IHHNV编码蛋白的原核表达、多克隆抗体制备及编码蛋白间相互作用研究

来源 :宁波大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangleisxh1234
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传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infection hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)是感染对虾的一种重要病原。然而,目前国内外对其展开的研究主要集中在分子流行病学、病理学及检测技术上,而对编码蛋白的相关基础研究鲜有报道。主要对其编码的非结构蛋白1(Nonstructural protein1,NS1)、非结构蛋白2(Nonstructural protein2,NS2)和衣壳蛋白(Capsid protein,CP)进行原核表达与多克隆抗体制备,结果显示病毒的NS2和CP在 Escherichia coli中能够成功表达,而NS1未能成功表达。对 NS2和 CP进行蛋白纯化时,纯化结果显示 NS2蛋白的纯度较高,可用于多克隆抗体的制备,而CP蛋白的纯度较低。NS2进一步免疫新西兰兔后,制备的抗血清效价较高,可用于后续病毒的检测及其他相关研究。  本研究利用Matchmaker酵母双杂交系统,将NS1、NS2和CP序列分别构建到酵母猎物载体pGADT7和诱饵载体 pGBKT7上,分别转化至酵母AH109以检测重组猎物载体和诱饵载体的自激活作用及对宿主的毒性作用,发现无自激活作用和毒性作用,随后将重组猎物载体和诱饵载体两两共转至酵母AH109中,涂布于SD/-Leu/-Trp固体培养基上,再点种至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal固体培养基以鉴定编码蛋白间的相互作用。表型鉴定结果显示,只有共转化有pGADT7-CP/pGBKT7-CP的酵母重组子能够在 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上生长并显蓝,而其它重组子均不能在其上生长,表明病毒的CP能够自身互作,而其他编码蛋白间无相互作用。为了进一步研究病毒CP自身互作的作用位点,分别从CP的N端和C端截短若干个氨基酸序列,结果发现CP的自身互作是高度敏感的,序列中较少氨基酸片段的缺失将导致其自身互作的丧失。本研究为深入探讨病毒的组装机制和致病机理奠定了坚实的理论基础。
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