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异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)取得了很大成就，但仍有许多患者因为无合适供者而失去移植机会。HLA半相合移植可使更多的患者得到移植的机会，但因为HLA半相合移植后GVHD的发生率和死亡率均很高，严重限制了其临床应用。HLA半相合CD34~+细胞移植扩大了供者来源，而且因为纯化的CD34~+细胞中T细胞减少4～5个数量级，移植物抗宿主病(GVHD)发生率和严重程度都大为降低；移植后免疫抑制剂的应用减少和对肝、肺等器官毒性减轻，使早期移植相关死亡率下降。但去除T细胞削弱了移植物抗白血病(GVL)效应导致移植后复发率增高、移植失败的可能性增加、患者细胞免疫功能严重低下易出现致命感染。结果患者生存率与非去T移植相比并无提高。因此，如何在HLA半相合CD34~+细胞移植中保留T细胞的治疗作用并消除其副作用，是目前迫切需要解决的问题。 将TK基因(自杀基因)体外转染供者T细胞成为TK~+T细胞，然后和CD34~+细胞混合移植，一旦发生GVHD，则给予特异性药物丙氧鸟苷治疗，选择性杀死引起GVHD的TK~+T细胞，使GVHD得到控制，同时又可保留T细胞的治疗作用。这样，HLA半相合CD34~+细胞和TK~+T细胞混合移植既能保留该移植方法的优点，又能克服其不足。根据这一设想，本文进行H-2半相合小鼠CD34~+细胞和TK~+T细胞混合移植的实验研究，为HLA半相合CD34~+细胞和TK~+T细胞混合移植的临床应用奠定基础。 目的 建立H-2半相合CD34~+细胞及TK~+T细胞混合移植GVHD模型和GCV治疗GVHD模型；观察H-2半相合CD34~+细胞及TK~+T细胞混合移植的GVL效应。为临床HLA半相合TK~+T细胞和CD34~+细胞混合移植提供实验依据。 解放军总医院军医进修学院 博士学位论文 方法 1．提高逆转录病毒载体滴度 包装细胞GP＋E86 经120urn加 的衣霉素 （tunicamycin）处理18小时后，再用预先收集的病毒上清转染、G418筛选 后，收集病毒上清测定滴度。 2．转染方法的选择 测定共培养法、离心法、脂质体一病毒混合法和标准法 等4种转染方法转染率，选择一种操作简便且转染率较高的转染方法。 3．建立混合移植 GVHD模型 以亲代 C57BL／6（H－2‘，8）为供鼠，Blab／c X C57BL／6 CB6FI（H一 2‘’‘，Y）为受鼠，移植前 4～6小时”CO 9．OGy全 身致死量照射。mIL－2和 ConA刺激供鼠脾脏T细胞增殖、转染 TK基因。 的18筛选及扩增：兔疫磁珠法从供鼠骨髓分离＊的细胞，两者混合后移 植受鼠。 4．建立“V治疗混合移植GVHD模型移植后0天或7天给予“V治疗，剂 量均为 50mg－‘．kg－‘．dX7，腹腔注射。GCV治疗组与对照组比较并比较 2种 GCV应用方法的疗效。 5．观察混合移植WL效应静脉接种CB6FI ／J’鼠EL96ll红白血病细胞，建 立“6n红白血病模型；以红白血病m6n（早）为受鼠，“mU6（8） 为供鼠，移植方法同上，移植后7天给予GCV治疗GVHD，观察GVL效应。 结果 1．包装细胞 GP＋E86 经衣霉素处理后，应用 NIH3T3 测定病毒滴度为 6 X 10’cfu／ml，衣霉素处理前病毒滴度是 3．SX 10’cfu／。l。 2．共培养法、离心法、脂质体一病毒混合法和标准法的转染率分别是 32．33％士2．12％、18，72％士2．97％、9．43％士1．81％及6．64％士1．37％。离心法 转染率虽较共培养法低，但操作简便且无包装细胞污染，实验中采用这种 转染方法。 3．建立的混合移植模型经症状和病理检查100％发生急性GVHD。GVHD死亡 4 解放军总医院军医进修学院 搏士学位论文 时间集中在移植后 2～3周。TK“T细胞和 T细胞诱导 GVHD的能力无差别。 4．GCV治疗组小鼠生存时间较对照组明显延长，P＜0．of。移植后 7天和 0 天给予GCV，小鼠生存时间分别为40．5士8．4天及26．6士4．8天，P＜0．05， 表明移植后7天给予GCV疗效较好。 5．成功建立红白血病EL96ll CB6FI模型接种10’白血病细胞，CB6FI小鼠即 可发病。在白血病细胞 10’～10’之间，接种细胞数量和发病时间呈负相关 （r＝－0．91）。混合移植组和化疗组红白血病CB6FI／J’鼠平均生存时间分别为 45．6士7．5天和30．5士5．2天，P＜0．01，表明混合移植具有WL效应。 小结 1．应用衣霉素处理包装细胞GP十E86后，逆转录病毒载体滴度提高15倍。 2．建立了 H－2半相合 CD34”细胞和 TK”T细胞混合移植的急性 GVHD模型。 以往进行GCV泊疗H－2半相合小鼠急性GVHD的研究中，急性GVHD模型的 建立采用供鼠骨髓单个核细胞和 TK＼细胞移植。我们利用纯化的 CD34”细 胞代替骨髓单个核细胞混合TK＼细胞移植。这种移植模