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目的： 参照朱仁康主编的《中医外科学》里中医辨证分型相关标准对非黑素瘤细胞性皮肤肿瘤(nonmelanoma skin cancer)患者进行中医证型分组，采用常规聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)和巢式聚合酶链反应(Nested Polymerase Chain React ion)的方法来检测NMSC患者组织标本中的一类特殊型HPV(EV型)，并对扩增产物DNA进行测序，旨在研究NMSC中医证型与HPV感染是否存在相关性。 材料： 标本来源于武汉市第一医院皮肤科门诊，40名患者均经过临床和组织病理确诊为NMSC。其中包括：①新鲜手术组织标本20例：鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)8例，基底细胞瘤(basal cell carcinoma)12例。手术切下组织后立刻保存于-70℃冰箱。②NMSC石蜡包埋组织标本20例：SCC15例，BCC5例。 方法： 1．分组：参照《中医外科学》里中医辨证分型标准将NMSC患者分成四组，其中疮感风毒型11例、肝火血燥型6例、元气虚弱型15例、肝肾亏损型8例。 2．新鲜手术标本DNA的提取：①每3-5mg组织研磨后加入200ul 1号缓冲液和30ul蛋白酶K(10mg／ml)，37℃孵育，24小时后加10mg／l蛋白酶K30ul，继续孵育24小时；95℃水浴加热10min，得到DNA粗提物。②DNA粗提物经过酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等纯化沉淀洗涤干燥等得到模板DNA。 3．新鲜手术标本的扩增：采用EV型通用引物CP65-CP70(CP65：5′CA(A／G)GGTCA(C／T)AA(C／T)AATGG(C／T)AT3′，CP70：5′AA(C／T)TTTCGTCC(C／T)A(A／G)AG(A／G)A(A／T)ATTG(A／G)TC3′，分别位于HPV-8基因组序列的6832—6851和7273—7298位置)和CP66-CP69(CP66：5′AATCA(A／G)(A／C)TGTTT(A／G)TTAC(A／T)GT3′，CP69：5′G(A／T)TAGATC(A／T)ACAT(C／T)CCA(A／G)AA3′分别位于HPV-8基因组序列的6862-6881和7231-7250位置)对新鲜手术标本进行巢式PCR，扩增HPV DNA。CP65-CP70扩增后得到目的片段为452-467bp的产物；然后用CP66-CP69进行第2步扩增得到目的片段为370bp左右的终产物。 4．石蜡包埋组织标本的DNA提取：①切10um厚石蜡包埋组织标本的切片5片，二甲苯脱蜡、乙醇洗涤，干燥后加TES缓冲液500ul、30ul蛋白酶K(10mg／ml)溶液和30ul 20％的SDS，56℃水浴72h，每24h加入等量蛋白酶K(30ul)一次。95℃水浴加热10min，得到DNA粗提物。②DNA粗提物经过酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等纯化沉淀洗涤干燥等得到模板DNA。 5．石蜡包埋组织标本的扩增：①用HPV通用引物FAP59／FAP64(FAP59：5，TAAC(T／C)GTIGGICA(C／T)CC(T／C)TATT-3′，FAP64：5，CC(T／C)ATATC(T／C)(A／C／G)(A／C／T)CATITCICCATC 3′)对石蜡包埋组织标本DNA扩增。 6．β-Globinl，β-Globin2参照PCR：β-Globinl and β-Globin2(β-Globinl：5′CAACTTCATCCACGTTCACC3′，β-Globin2：5′GAAGAGCCAAGGACAGGTAC3′)引物作为参照PCR，用于验证DNA模板的质量。 7．对部分扩增产物进行测序，测序结果与GenBank上的已知序列进行对比、分型。