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第一部分Salubrinal对Tunicamycin诱导的ERS介导的大鼠髁突软骨细胞凋亡保护作用研究[目的]研究Salubrinal对Tunicamycin诱导的ERS介导的原代大鼠髁突软骨细胞凋亡的保护作用。[方法]1.选取3周龄SD大鼠,取髁突软骨进行原代培养,并对第三代髁突软骨细胞进行Ⅱ型胶原表型鉴定。2.用4μg/ml Tunicamycin处理软骨细胞或用40μM Salubrinal预处理30min后,再加入4μg/ml Tunicamycin,在处理后24h收集细胞。实验分为四组：对照组、Salubrinal组、Tunicamycin组、Salubrinal+Tunicamycin组。采用流式细胞方法检测细胞凋亡率。采用实时荧光定量PCR检测GRP78. GRP94. CHOP. Caspase-12mRNA水平改变和Western印迹法检测GRP78. GRP94. CHOP. Caspase-12蛋白水平表达改变。[结果]1. Tunicamycin处理大鼠髁突软骨细胞24小时后,细胞凋亡率显著上升(P<0.05)。Salubrinal组细胞凋亡率与空白对照组无显著差异。Salubrinal+Tunicamycin组细胞凋亡率较Tunicamycin组显著降低(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.05)。2. Tunicamycin诱导大鼠髁突软骨细胞GRP78、GRP94、CHOP、Caspase-12mRNA及其蛋白水平上表达升高。Salubrinal可以降低Tunicamycin诱导的大鼠髁突软骨细胞GRP78、GRP94、CHOP、Caspase-12mRNA及其蛋白水平上表达升高。[结论]1. Tunicamycin可以诱导大鼠髁突软骨细胞发生ERS,进一步导致细胞凋亡增加。2. Salubrinal可以通过缓解大鼠髁突软骨细胞ERS,对Tunicamycin诱导的凋亡起保护作用。第二部分内质网应激在周期性牵张力-下大鼠髁突软骨细胞中的作用研究[目的]研究内质网应激在周期性牵张力下大鼠髁突软骨细胞的作用。[方法]1.选取3周龄SD大鼠,取髁突软骨进行原代培养、表型鉴定。所有实验均使用第3代髁突软骨细胞。2.对细胞施加12%0.5Hz1/2正弦波形周期性牵张力(cyclic tensile stress, CTS)后,实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原表达改变,流式细胞术检测细胞凋亡率。3.对细胞施加12%0.5Hz1/2正弦波形周期性牵张力或用4μg/ml Tunicamycin预处理30min后加力,处理24小时后收集细胞。实验分为四组：对照组、Tunicamycin组、CTS组、CTS+Tunicamycin组。采用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测ERS标志分子GRP78、GRP94、CHOP、Caspase-12表达的改变。[结果]1.12%0.5Hz1/2正弦波形周期性牵张力作用24h后,Ⅱ型胶原mRNA水平表达下降(P<0.05)；但髁突软骨细胞凋亡率与对照组无显著性差异。2.12%0.5Hz1/2正弦波形周期性牵张力作用24h后,髁突软骨细胞GRP78、 GRP94、CHOP、Caspase-12的mRNA和蛋白水平上的表达与对照组无显著性差异。但CTS+Tunicamycin组大鼠髁突软骨细胞GRP78、GRP94、CHOP在mRNA和蛋白水平上的表达较Tunicamycin组增加,其中CHOP的增加具有统计学意义(P<0.05)。[结论]1.12%0.5Hz1/2正弦波形CTS作用24h后大鼠髁突软骨细胞未见发生明显的ERS,细胞未发生凋亡,但Ⅱ型胶原表达下降。2.12%0.5Hz1/2正弦波形CTS和ERS诱导剂联合作用下,能加重ERS的发生。