肝癌是广西高发的一种地域性肿瘤,也是全球常见恶性肿瘤之一,严重危害着人民的身体健康与生活质量,当务之急是要寻找更安全有效的抗肝癌药物。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在茶叶中含量非常丰富,是活性最高的一种儿茶素,具有抑制肿瘤、逆转肝癌多药耐药性、抗氧化作用、抑制血管生成等广泛的药理活性。EGCG可通过抑制HIF-1α抑制肝癌细胞的生长和肝癌新生血管形成,逆转肝癌MDR,抑制蒽环类抗生素代谢。但由于EGCG性质不稳定,脂溶性差,生物利用度低,体内代谢快,维持时间短,作用强度有待提高。本研究以EGCG为先导化合物,对其进行结构修饰,合成并分离出EGCG结构修饰衍生物;通过细胞生物学、分子生物学和实验动物模型等对EGCG结构修饰衍生物进行体外抗肝癌作用筛选,探讨其抗肝癌作用机制,并应用计算机软件将衍生物与靶蛋白进行分子对接和ADME性质预测,分析其构效关系,研究EGCG结构修饰衍生物对蒽环类抗肿瘤药物的增敏减毒作用,以期寻找比EGCG高效、低毒、稳定的衍生物,拓展EGCG的抗肝癌应用范围,为更好地开发EGCG结构修饰衍生物成为新型多靶点抗肝癌药物提供实验依据和理论基础。第一部分 EGCG结构修饰衍生物的制备目的 对EGCG的侧链酚羟基进行乙基化,制备EGCG乙基化修饰衍生物。方法 以EGCG为反应底物,丙酮为反应介质,氮气为保护气,碳酸钾为催化剂,与(CH3CH2O)2SO2进行化学反应,合成EGCG乙基化衍生物。采用中压制备液相色谱法对反应产物进行分离纯化。对纯化所得产物通过1H-NMR、13C-NMR、2DNMR、质谱等方法进行结构鉴定。结果共获得六个乙基化程度不同的EGCG乙基化衍生物,鉴定其结构分别为 5,7,3’ 4’,5’,3",4",5"-八-O-乙基-EGCG(Y1)、5,7,3’,4’,3",4",5"-七-O-乙基-EGCG(Y2)、5,7,4’,5’,3",4",5"-七-O-乙基-EGCG(Y3)、5,3’,4’,5’,3",4",5"-七-O-乙基-EGCG(Y4)、5,7,3’,4’,3",4"-六-O-乙基-EGCG(Y5)、5,3’,4’,3",4",5"-六-O-乙基-EGCG(Y6))结论制备所得六个新化合物为EGCG乙基化修饰衍生物。第二部分EGCG结构修饰衍生物体外抗肝癌作用及其机制的研究目的对EGCG结构修饰衍生物进行体外抗肝癌作用的活性筛选,并初步分析其作用机制和构效关系,以期筛选出比母体EGCG活性更强或性质更为稳定的EGCG衍生物。方法采用MTT法检测EGCG乙基化衍生物对SMMC-7721、HepG2肝癌细胞的增殖抑制率,计算IC50;在常氧及缺氧条件下培养肝癌细胞,以Real-time PCR及Western blot法分别检测EGCG乙基化衍生物和乙酰化衍生物AcEGCG对肝癌细胞HIF-1 α、VEGF和CBR1基因及蛋白表达的影响;采用计算机软件对EGCG结构修饰衍生物进行分子对接及ADME性质预测。结果(1)MTT实验显示,EGCG乙基化衍生物Y5和Y6在体外均能抑制SMMC-7721和HepG2肝癌细胞生长,对于SMMC-7721肝癌细胞,衍生物Y5和Y6的IC50分别为232.9μmol/L、61.4μmol/L,明显低于EGCG(247.8μmol/L);对于HepG2肝癌细胞,衍生物Y5和Y6的IC50分别为229.9μmol/L、43.5μmol/L,也明显低于 EGCG(357.11μmol/L),尤以衍生物Y6的IC50最低。(2)Real-time PCR实验结果显示,在缺氧环境下SMMC-7721和HepG2肝癌细胞HIF-1 α、VEGF和CBR1基因表达显著增加(P<0.01)。EGCG乙基化衍生物Y6及AcEGCG显著下调SMMC-7721肝癌细胞的HIF-1α、VEGF和CBR1基因表达(P<0.01或P<0.05);对HepG2肝癌细胞的HIF-1α和VEGF基因表达也有抑制作用(P<0.01或P<0.05),各药高剂量对CBR1基因表达有抑制作用(P<0.05)。(3)Western blot实验结果显示,在缺氧环境下SMMC-7721和HepG2肝癌细胞中HIF-1 α、VEGF和CBR1蛋白表达显著增加(P<0.01)。EGCG乙基化衍生物Y6及AcEGCG显著下调SMMC-7721肝癌细胞的HIF-1α、VEGF和CBR1蛋白表达(P<0.01或P<0.05),但低剂量对CBR1蛋白表达抑制作用不明显(P>0.05);对HepG2肝癌细胞的HIF-1α和VEGF蛋白表达也有抑制作用(P<0.01或P<0.05),但对CBR1蛋白表达无显著影响(P>0.05)。(4)分子对接结果显示,对于靶蛋白HIF-1α和VEGFR,化合物的亲和力依次为Y6>Y5>AcEGCG>EGCG,对于靶蛋白CBR1,亲和力依次为Y6>Y5>EGCG>AcEGCG。(5)ADME性质预测结果显示,亲脂性由大到小依次为 Y6>Y5>AcEGCG>EGCG。结论EGCG乙基化衍生物Y5和Y6体外抗肝癌作用比EGCG强;EGCG结构修饰衍生物的抗肝癌作用机制与抑制HIF-1 α、VEGF和CBR1有关;EGCG结构修饰衍生物与靶蛋白HIF-1 α、VEGF和CBR1的亲和力比EGCG强;EGCG结构修饰衍生物的亲脂性大于EGCG。第三部分EGCG结构修饰衍生物对血管生成的影响目的研究EGCG结构修饰衍生物对体内外血管生成的影响,进一步探讨其抗肝癌作用机制。方法以MTT法检测EGCG结构修饰衍生物对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外增殖的抑制作用;采用鸡胚尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)模型,观察EGCG结构修饰衍生物对鸡胚新生血管生成的影响。结果(1)MTT实验结果显示,EGCG、AcEGCG和EGCG乙基化衍生物Y6对人脐静脉内皮细胞均有较强抑制作用,具有一定剂量依赖性。EGCG、AcEGCG和EGCG乙基化衍生物Y6的IC50分别为209.3μmol/L、97.9μmol/L 和 62.7μmol/L。AcEGCG 和 EGCG 乙基化衍生物 Y6 的 IC50 均比EGCG的低,而Y6的IC50最低。(2)CAM模型实验结果显示,EGCG乙基化衍生物Y6及AcEGCG可引起CAM各级血管均数减少,但对Ⅰ级血管的影响与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。各药对Ⅱ、Ⅲ级血管均有显著抑制作用(P<0.05或P<0.01),EGCG乙基化衍生物Y6及AcEGCG高、中剂量组对Ⅱ级血管有显著抑制作用(P<0.05),高、中、低剂量组对Ⅲ级血管抑制作用显著(P<0.01或P<0.05),呈剂量依赖性(P<0.05或P<0.01);与相同摩尔数的EGCG作用比较,EGCG乙基化衍生物Y6及AcEGCG对Ⅱ、Ⅲ级血管的抑制作用无显著性差异(P>0.05)。结论EGCG结构修饰衍生物AcEGCG和Y6在体内外均能抑制血管生成,其中AcEGCG和Y6在体外抑制血管作用比EGCG强,在体内对血管生长抑制作用与EGCG无显著差异;其抗肿瘤作用机制可能与抑制血管生成有关。第四部分EGCG结构修饰衍生物增效蒽环类药物抗肝癌作用的实验研究目的研究EGCG乙基化衍生物Y6与蒽环类抗肿瘤药物体外联合用药的协同效果。方法以体外培养人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2为研究对象,通过MTT法检测EGCG乙基化衍生物Y6与蒽环类药物柔红霉素(DNR)联合用药对肝癌细胞增殖的影响,以流式细胞术检测两药联用对肝癌细胞凋亡水平的影响。结果(1)MTT法检测结果显示,与DNR单独用药组比较,EGCG与Y6分别联合DNR用药组对SMMC-7721和HepG2肝癌细胞的增殖抑制率均增大,具有协同作用。且DNR联合用药的IC50比DNR单独用药的IC50低。但衍生物Y6(23.9μmol/L)联合用药量比EGCG(65.4μmol/L)小,其增效作用强于EGCG。(2)流式细胞术结果显示,对于SMMC-7721肝癌细胞,DNR(0.30μg/ml)单独作用的凋亡诱导率为(10.59±1.32)%,DNR(0.30μg/ml)分别与 EGCG(30μg/ml)、Y6(15μg/ml)联合用药,凋亡诱导率分别增加至(16.31±2.39)%、(16.19±2.21)%(P<0.05);而衍生物 Y6(15μg/ml,即 23.9μmol/L)联合用药量比 EGCG(30μg/ml,即65.4μmol/L)小,增效作用强于EGCG。对于HepG2肝癌细胞,DNR(0.75μg/ml)单独作用的凋亡诱导率为(27.19±2.39)%,DNR(0.75μg/ml)分别与EGCG(30μg/ml)、Y6(8μg/ml)联合用药,凋亡诱导率分别增加至(35.23±2.04)%、(33.16±1.83)%(P<0.05);而衍生物 Y6(8μg/ml,即12.8μmol/L)联合用药量比EGCG(30μg/ml即65.4μmol/L)小,增效作用强于EGCG。结论 EGCG乙基化衍生物Y6能够增效DNR对肝癌细胞增殖的抑制作用,提高DNR对肝癌细胞凋亡的诱导率,并且效果优于母体化合物EGCG。第五部分 EGCG结构修饰衍生物降低蒽环类药物心脏毒性的实验研究目的 研究EGCG结构修饰衍生物对蒽环类抗肿瘤药物心脏毒性的防治作用,并初步探讨其作用机制。方法 以阿霉素(DOX)诱导斑马鱼心脏毒性模型,观察EGCG结构修饰衍生物对心脏形态及心脏搏出量的影响;以柔红霉素(DNR)复制小鼠心脏毒性模型,观察AcEGCG和EGCG对小鼠心电图、心肌酶、高敏肌钙蛋白T(TNT-Hs)、SOD、MDA等生化指标的影响,电镜下观察心肌超微结构的变化。结果(1)斑马鱼心毒性实验结果显示,EGCG乙基化衍生物Y6、AcEGCG和EGCG可不同程度地对抗DOX所致斑马鱼的心脏毒性,改善心脏形态、增加心脏搏出量,其中以EGCG乙基化衍生物Y6的减毒作用最强,与模型组比较,差异非常显著(P<0.001)。(2)小鼠心毒性实验结果显示,AcEGCG和EGCG可以改善DNR所致心脏毒性小鼠的一般生长状况,不同程度降低小鼠心律失常发生率;抑制血清心肌酶ALT、AST、CK、CK-MB、LDH和α-HBDH活性,降低血清TNT-Hs水平,提高血清和心肌SOD活性,降低MDA含量,与模型组比较,差异显著(P<0.05或P<0.01);电镜下观察,可见AcEGCG和EGCG用药组小鼠心肌超微结构损伤比模型组减轻,两药作用强度无显著性差异。结论 EGCG结构修饰衍生物可不同程度对抗蒽环类药物引起的心脏毒性,减轻心肌损害。