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背景:我国地表水富营养化和藻类污染已十分严重。微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是淡水水体富营养化后最为常见的藻毒素,黄河、长江、滇池、巢湖、太湖等水体中均检出不同程度微囊藻毒素的污染。目前在饮用水和水产品中均已检测出微囊藻毒素污染,饮用水安全问题已严重威胁人类健康。由于现行自来水处理工艺以及常规食品加热均不能有效去除微囊藻毒素及其毒性。因此微囊藻毒素污染已经成为威胁人们饮用水安全以及食品安全的重要问题。微囊藻毒素对肝脏有选择性毒性。大量研究表明微囊藻毒素是引起肝癌发生主要因素之一。而我国肝癌的死亡率和发病率一直居高不下,是严重威胁人类的生命和健康的疾病。大量研究表明,表观遗传学在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用,它包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA等。与肿瘤相关基因的CpG岛的甲基化的发生使相关基因的表达异常与肿瘤的发生关系密切。因此寻找微囊藻毒素诱导的肝癌过程中相关基因的甲基化变化,将为后续微囊藻毒素诱导的肝癌的研究提供新的思路。在前期研究中,我们建立了微囊藻毒素诱导肝细胞恶性转化细胞模型,并对恶转细胞进行甲基化芯片和表达谱芯片筛选,分析发现ALX4基因是一个发生高甲基化的基因。但目前该基因在微囊藻毒素诱导肝癌发生过程中的研究还比较少,具体分子机制尚不清楚。本课题拟通过对ALX4基因在微囊藻毒素诱导肝癌发生过程中的表观遗传学变化及作用机制进行研究,初步探索ALX4基因在微囊藻毒素诱导肝癌的发生发展过程中发挥的主要功能及分子机制。本研究将为下一步深入研究ALX4基因在微囊藻毒素诱导的肝癌发生发展过程的机制提供有价值的线索,并为全面认识微囊藻毒素诱导肝癌发生提供重要参考资料。目的:1.探讨在MC-LR诱导肝癌发生过程中ALX4基因的表观遗传学动态变化及其机制。2.初步探索ALX4基因在MC-LR诱导肝癌的发生发展过程中发挥的主要功能及其分子机制。方法:1.采用Q-PCR和WB检测ALX4基因在MC-LR诱导的L02恶性转化细胞中的表达;同时检测ALX4基因在MC-LR染毒的动物模型中的表达。2.采用MSP和BSP检测ALX4基因在MC-LR诱导的L02恶性转化细胞中的甲基化发生情况,利用去甲基化实验进一步验证。3.建立ALX4基因在MC-LR诱导的L02恶性转化细胞的高表达和低表达模型,并通过高低表达的细胞模型分析ALX4基因在MC-LR诱导肝癌发生过程中的作用。用CCK8发检测细胞的增殖情况;用克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力;用流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡;用划痕实验和Transwell分析MC-LR诱导的L02细胞的侵袭和转移的能力。4.利用裸鼠成瘤实验分析ALX4基因在体内对肿瘤生长的影响,以及用Ki67检测增殖,用TUNEL检测凋亡。5.采用Q-PCR和WB检测ALX4基因在MC-LR诱导的肝癌中作用的分子机制,明确ALX4基因在MC-LR诱导的肝癌中发挥作用的主要信号通路。结果:1.随着MC-LR诱导的L02恶性转化细胞代数的增加,ALX4基因表达水平逐步下调。在MC-LR染毒的动物模型中,与对照组相比,染毒组中ALX4基因的表达明显下调,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.ALX4基因在MC-LR诱导的L02恶性转化细胞中发生了高甲基化,并且可能由于DNA甲基化导致ALX4基因在MC-LR诱导的肝癌中低表达。3.ALX4基因过表达后促进了MC-LR诱导L02恶性转化细胞的凋亡,抑制MC-LR诱导的L02恶性转化细胞的增殖、克隆形成、侵袭和转移,并阻滞MC-LR诱导恶性转化细胞在G1/S期。4.干扰外源稳定表达ALX4基因细胞中ALX4的表达后,MC-LR诱导L02恶性转化细胞的增殖、克隆形成以及侵袭和转移显著增强。5.在裸鼠成瘤实验中,ALX4基因明显抑制了肿瘤的生长。同时在体内也明显表明了ALX4基因抑制了MC-LR染毒细胞的增殖,促进了MC-LR诱导恶性转化细胞的凋亡。6.在MC-LR诱导的肝癌中,ALX4基因发挥抑癌作用主要与ALX4基因过表达后可以促进P53基因及其下游靶分子Bax表达,同时抑制Bcl-2、C-MYC和MMP9表达有关。而干扰ALX4基因的表达后则可以抑制P53基因及其下游靶分子Bax和促进下游靶分子Bcl-2的表达,同时促进了C-MYC和MMP9的表达。结论:ALX4基因在MC-LR诱导的肝癌中低表达,可能是因为发生了高甲基化而使ALX4基因的表达下调;ALX4基因抑制MC-LR诱导的肝癌细胞的增殖、侵袭和转移,并使细胞的G1/S期阻滞;ALX4基因在MC-LR诱导的肝癌中发挥抑癌作用与P53信号通路等有关。此次研究使我们对MC-LR诱导的肝癌发生的机制有了一定的认识,同时为ALX4基因在其它的恶性肿瘤的机制研究提供了有价值的线索。