柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是柑橘生产上最具毁灭性的病害,目前全球50余个国家有黄龙病发生,已对包括我国在内的许多国家的柑橘产业造成巨大的经济损失。其病原为韧皮部杆菌属（Liberibacter）难培养细菌,根据16S r DNA序列特征可将其分为3个种:亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas）、非洲种（‘Ca.Liberibacter africanus’,CLaf）和美洲种（‘Ca.Liberibacter americanus’,CLam）。其中,CLas在全球的分布最广、为害最大,也是我国分布流行的柑橘黄龙病致病种。柑橘黄龙病的致病机理尚不明确,目前在柑橘栽培种中没有发现抗黄龙病种质,也尚无彻底消灭感病植株中黄龙病菌的治疗药剂,植株一旦感病只能砍除销毁,给柑橘产业发展构成了极大的威胁。迄今,黄龙病菌依然不能进行体外纯培养,而且感病植株中黄龙病菌的浓度较低且分布不均,这极大地限制了病原生物学和病原-寄主互作机制的研究。因此,本研究基于柑橘腋芽离体再生技术,以感病甜橙腋芽为试材,构建了一种柑橘黄龙病菌快速增殖的半离体培养系统,探明了半离体培养条件下病原菌的增殖规律和寄主的生物学症状。进一步,利用构建的培养系统,运用高通量测序技术研究了CLas半离体状态下寄主内生细菌群落结构,通过转录组测序分析了寄主应答CLas感染的早期响应机制。同时,制备了两种既可激发荧光又能结合四环素分子的纳米药物载体（碳量子点）,通过活体荧光成像观察和组织切片荧光检测分析碳量子点及其载药纳米颗粒在柑橘苗体内的运输与分布,并基于CLas快速增殖的半离体培养系统评价碳量子点载药（四环素）对柑橘黄龙病菌的杀灭效果。主要研究结果如下:1.成功构建一种柑橘黄龙病菌快速增殖的半离体培养系统。通过感染黄龙病长叶橙茎段离体培养,发现CLas可以移动至柑橘腋芽离体再生嫩梢中,并且能快速增殖;在腋芽萌芽30d时,嫩梢的CLas浓度平均值为温室条件下感病柑橘植株上该腋芽对应叶片中脉的28.2倍。在解决感病柑橘外植体培养污染难题的基础上,结合微嫁接技术,建立了一种柑橘黄龙病菌快速增殖和高浓度富集的半离体培养方法,并明确了CLas在半离体培养寄主中的增殖规律:感病腋芽萌芽10 d时,PCR（聚合酶链式反应）即可检测到CLas,PCR阳性率为10%,萌芽30和40 d时PCR阳性率分别为55%和70%;实时定量PCR（q PCR）分析,发现萌芽10 d嫩梢的CLas浓度平均值在10~4 CLas cells/μg citrus DNA水平,而萌芽30 d时带菌嫩梢的CLas浓度平均值达10~8 CLas cells/μg citrus DNA,增涨1,600倍;并且萌芽30和40 d嫩梢的病原菌浓度高于10~8的比例分别占30%和40%。直接组织点免疫（DTBIA）检测结果显示,黄龙病菌在其半离体培养寄主中的分布比温室感病植株韧皮部中的分布更为均匀。症状观察发现,CLas半离体培养状态下寄主柑橘苗的发病速度较快,微嫁接的感病腋芽萌芽10 d时,即出现落叶症状,培养过程中,寄主的主要症状有叶片黄化、滞育、脱落和嫩梢枯死;萌芽40 d时柑橘苗的死亡率为19.9%,萌芽60 d时死亡率达82.0%。2.CLas半离体培养寄主内生细菌具有丰富的多样性,并发现与CLas菌群丰度存在相关性细菌。通过微嫁接技术将CLas接种到柑橘试管苗,经过CLas半离体培养使其浓度富集到10~7 CLas cells/μg citrus DNA以上水平,运用高通量测序技术进行细菌16S r DNA测序,对CLas半离体培养寄主内生细菌的群落结构进行分析。结果共获得535个操作分类单元（OTUs）,归属于21个门、49个纲、106个目、156个科、242个属,其中116个OTUs注释到种水平。CLas半离体培养寄主和健康对照的内生细菌群落结构在各分类等级上均存在显著性差异,健康对照内生细菌的优势菌属主要为未鉴定的蓝藻菌。CLas半离体培养寄主内生细菌具有丰富的多样性,其优势菌群主要为韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、产碱菌属（Alcaligenes）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、伯克氏菌属（Burkholderia）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、丙酸杆菌属（Cutibacterium）、沙雷氏菌属（Serratia）、甲基杆菌属（Methylobacterium）和葡萄球菌属（Staphylococcus）。除CLas外,短波单胞菌（B.marcescens）、粪产碱杆菌（A.faecalis）、伯克氏菌（Burkholderia）和丙酸杆菌（Cutibacterium）,可作为区分感染CLas组和健康组的生物标识（Biomarker）。通过相关性分析发现,短波单胞菌和粪产碱杆菌与CLas菌群丰度之间存在显著正相关,推测短波单胞菌、粪产碱杆菌等微生物可能与CLas存在共生关系。3.CLas半离体培养条件下柑橘响应病原菌侵染的转录组学研究。通过带菌和健康长叶橙茎段的离体培养,以萌芽10和20 d的嫩梢为材料进行转录组测序分析。结果发现,CLas半离体培养条件下,长叶橙腋芽再生早期阶段的转录水平上发生了显著变化。萌芽10 d时2/3的差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）受CLas诱导上调表达（836个DEGs上调表达,420个DEGs下调表达）,萌芽20 d有56%的DEGs下调表达（2474个DEGs下调表达,1891个DEGs上调表达）;两个时间点共有591个相同的DEGs。通过GO功能富集分析发现,萌芽10 d的DEGs显著富集的GO terms仅与分子功能相关,主要涉信号识别、转录调控和氧化还原等,而萌芽20 d DEGs显著富集的GO terms与分子功能、细胞组分和生物学过程3类功能均相关。通过KEGG通路富集分析发现,萌芽10 d受CLas诱导上调表达的DEGs显著富集于植物-病原菌互作、植物MAPK信号和激素信号转导3个途径。进一步利用Map Man对两个时间点的DEGs进行功能分类,发现其中407个DEGs与植物响应生物胁迫相关,主要涉及信号转导、转录调控、激素代谢、抗病蛋白、细胞壁代谢、蛋白质降解、氧化还原反应和次生代谢等途径。从DEGs整体水平来看,柑橘响应生物逆境胁迫的信号转导和转录调控相关基因被CLas诱导表达,水杨酸、茉莉酸信号介导的防御反应通路和乙烯合成与信号传导途径被激活,而生长素、赤霉素合成与代谢途径相关基因的表达受到显著影响。值得注意的是,类受体蛋白激酶基因（RLP15、RLP56）、抗病相关基因（EDS1、TIR-NBS-LRR类抗病蛋白基因、NPR1、NDR1、PR1、PR4和PR5a）、脂氧合酶基因（LOX2）和韧皮部蛋白基因PP2-B10在萌芽10和20 d嫩梢中均被CLas诱导高水平上调表达;同时发现抵御病原菌的负调控因子RIN4、乙烯响应因子（ERF1B、ERF2）、AAC合酶基因（ACS1）和细胞程序性死亡调控相关基因（SAG12）等也受CLas诱导高水平上调表达。4.基于CLas半离体培系统进行药效评价,发现纳米药物载体可有效增强四环素对柑橘黄龙病菌的杀灭作用。制备了两种纳米药物载体——绿色荧光碳量子点（CDsa）和蓝色荧光量子碳点（CDsb）。CDsa和CDsb的最佳发射波长分别为502和443 nm,均在360 nm波长激发光下发射的荧光强度最强。两种碳量子点的平均粒径均小于10 nm,其颗粒表面均带有羟基、氨基和羰基等活性官能团,能与四环素分子结合,可作为四环素的纳米药物载体。通过活体荧光成像和组织切片荧光检测,发现这两种碳量子点及其负载四环素（TC）的纳米颗粒（CDsa-TC和CDsb-TC）均可以通过根吸收进入柑橘苗体内,并向上运输到茎和叶中;碳量子点也可以通过叶表面吸入体内运输到茎和根部。组织切片荧光检测发现TC进入柑橘苗体内后也可激发特色荧光,但是其荧光分布结果显示,TC在韧皮部组织中的浓度较低,而CDsa-TC和CDsb-TC在柑橘苗根、茎、叶韧皮部中的分布明显增强,表明这两种纳米药物载体均能有效提高TC在植物组织和细胞中的穿透能力。本研究制备的CDsa和CDsb的植物毒性低,但TC对柑橘的植物毒性较强。TC浓度超过500 mg/L时会对柑橘种子的萌芽率和根茎伸长造成严重影响,对柑橘苗体内的抗氧化酶系统也会造成破坏。进一步利用CLas半离体培养系统,评价纳米药物载体载四环素对柑橘黄龙病菌的杀灭作用。采用浸泡带菌柑橘苗根的处理方式,比较四环素浓度150、300和450 mg/L的CDsa-TC、CDsb-TC和TC对黄龙病菌的杀灭效果,结果显示,药剂处理后,CLas半离体培养寄主的存活率显著高于非处理对照,黄龙病菌PCR检测阳性率也大为降低;CDsa-TC和CDsb-TC处理的阳性率低于单独使用TC处理组,而且其中2个碳量子点载药处理组（300 mg/L CDsa-TC和450 mg/L CDsb-TC）的黄龙病菌PCR检测阳性率为0。说明纳米药物载体能有效增强四环素对柑橘黄龙病菌的杀灭作用。