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目的:血管性痴呆(vasculardementia,VD)是由各种脑血管疾病导致的获得性、持续性智能障碍综合征,是老年期痴呆的主要类型。明显的,进行性的学习记忆能力的损害是VD的主要临床症状,至今对其尚无有效的防治措施。随着社会人口的日益老龄化和脑血管病发病率的不断上升,VD的发病呈迅速增长趋势,给社会和家庭带来沉重的负担。目前认为,慢性脑灌注不足是VD的主要原因,海马的胆碱能系统与认知功能直接相关。海马是大脑的一个重要结构,在学习和记忆中起着重要的作用,隔内侧核和Broca斜角带核的胆碱能神经元是海马胆碱能纤维的主要来源,其释放递质乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)至海马,参与学习、记忆的形成。脑组织缺血缺氧,导致海马神经细胞的数量减少和功能障碍,影响胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)和胆碱乙酰转移酶(cholineacetyltransferase,ChAT)的分布与含量,从而引起Ach的改变。作为改善智能障碍的一线药物,喜得镇(hydergine,化学名:甲磺酸二氢麦角碱)已广泛应用于VD的治疗,但其治疗VD的药理机制却尚在探讨中。本实验通过建立VD模型,观察其海马AchE和ChAT的变化,探讨VD发病的胆碱能机制及喜得镇改善智能,提高VD患者学习、记忆的胆碱能药理机制。
方法:本研究分为三部分。第一部分以昆明小鼠为研究对象,采用双侧颈总动脉丝线结扎方法、经连续三次反复缺血-再灌注,制备VD模型,并设立假手术组、药物组(喜得镇);造模术后第29、30d,利用跳台试验和水迷宫试验对各组小鼠分别进行学习和记忆成绩测试,并观察各组小鼠行为学差异。第二部分采用迅速取材,4%多聚甲醛溶液固定的小鼠脑组织为研究对象,分别用免疫组化和原位杂交技术,在光镜下观察各组小鼠海马组织ChAT和ChATmRNA的表达变化,并且计算其海马CA1区ChAT和ChATmRNA阳性细胞的面密度值,比较各组海马的表达是否差异。第三部分以采用快速取材、分离低温保存的海马组织作为研究对象,比较各组小鼠海马AchE活性有无差别。
结果:(1)跳台试验:模型组小鼠学习、记忆成绩显著下降,表现为学习阶段的反应时间延长(P<0.01)、错误次数增加(P<0.01),记忆阶段的潜伏时间缩短(P<0.01)、错误次数增加(P<0.01);药物组较模型组学习、记忆成绩明显改善(P<0.01),并且与假手术组比较无差别(P>0.05)。(2)水迷宫试验:模型组小鼠学习、记忆成绩也显著下降,表现为学习阶段的游全程时间延长和错误次数增加(P<0.01),记忆阶段的游全程时间延长和错误次数增加(P<0.01);药物组较模型组明显改善(P<0.01),并且与假手术组之间无差别(P>0.05)。(3)海马硫堇染色:假手术组海马硫堇染色显示海马轮廓清楚、锥体细胞3-5层,数量丰富,排列规则致密,细胞核圆而大,核仁清晰,胞浆内尼氏体丰富,神经纤维密集;模型组海马CA1区锥体细胞层次减少,排列松散,锥体细胞数目减少,胞浆内尼氏体减少甚至消失,细胞核体积变小,深染,结构不清,呈核固缩表现,神经纤维排列紊乱;而药物组病理改变明显减轻。(4)海马ChAT及其mRNA的表达变化:在光镜下,假手术组海马CA1区层次清楚,有大量的阳性神经元,排列紧密,呈棕黄色,胞体较大,圆形或椭圆形,有的可见突起。而模型组阳性神经元数目明显减少,排列松散,染色较淡。药物组可见阳性神经元数目较模型组增多,排列较紧密,染色变深。经过计算阳性细胞面密度值发现,与假手术组比较,模型组小鼠海马ChAT及其mRNA的阳性神经元面密度值降低(P<0.01),而药物组ChAT及其mRNA的阳性神经元面密度值增加,与模型组比较有差别(P<0.01),并且与假手术组无差别(P>0.05)。(5)海马AchE活性:与假手术组相比,模型组小鼠海马组织AchE活性显著降低(P<0.01),而药物组与模型组比较,AchE活则明显升高(P<0.05)。
结论:(1)本实验成功地建立了小鼠VD模型,经过跳台试验、水迷宫试验证实了VD小鼠存在学习和记忆能力障碍,能够基本模拟临床上VD的智能障碍,海马硫堇染色显示海马锥体细胞受损,是比较理想的VD动物模型;同时,也证实了喜得镇的治疗效果。(2)采用免疫组化和原位杂交技术,证实了海马组织ChAT及其mRNA的表达减少参与了VD的认知功能损害;喜得镇可以通过促进海马ChAT、ChATmRNA的表达,增加Ach的合成,进而提高Ach含量而改善VD的临床症状。(3)运用Beckman全自动生化分析仪,证实了海马AchE活性降低参与了VD的发病;喜得镇可以升高VD小鼠海马AchE活性,反映了胆碱能系统功能的改善。