【摘 要】
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黄酒酵母作为黄酒发酵过程中的主导微生物,其对氮源利用有独特的偏好性,易产生尿素及其它含氮化合物,从而影响发酵黄酒的品质。因此,鉴定黄酒酵母菌株间的差异表达蛋白,解析氮代谢调控途径具有重要的学术意义和应用价值。本论文首先以三株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株YJSH1、N85和XZ11为研究对象,探究三株菌株在以精氨酸为唯一氮源培养条件下的蛋白质组差异,鉴定与黄酒酵母
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黄酒酵母作为黄酒发酵过程中的主导微生物,其对氮源利用有独特的偏好性,易产生尿素及其它含氮化合物,从而影响发酵黄酒的品质。因此,鉴定黄酒酵母菌株间的差异表达蛋白,解析氮代谢调控途径具有重要的学术意义和应用价值。本论文首先以三株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株YJSH1、N85和XZ11为研究对象,探究三株菌株在以精氨酸为唯一氮源培养条件下的蛋白质组差异,鉴定与黄酒酵母氮源利用偏好有关的关键蛋白及其代谢途径。然后,为验证差异蛋白质的功能,构建了黄酒酵母菌株的CRISPR/Cas9基因组编辑技术的实验体系,为进一步通过定向基因改造以优化黄酒酵母的发酵性能奠定基础。本论文的主要研究内容如下:（1）黄酒酵母菌株间的差异表达蛋白鉴定。首先研究酵母菌株YJSH1、N85和XZ11在以精氨酸为唯一氮源的条件下的生长差异,并选择对数生长中期为蛋白样本取样点;然后利用定量蛋白质组学串联质量标签（Tandem Mass Tags,TMT）标记技术、高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）和液相色谱串联质谱（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MC）技术分离定量蛋白质,共鉴定4005个可定量的蛋白。三株菌株两两对比按照相对定量值大于1.5倍或小于1/1.5倍,且统计学T检验p小于0.05筛选,一共得到793个差异表达蛋白。（2）差异表达蛋白功能注释分析。利用功能注释和数据统计等生信手段对差异表达蛋白进行分析。首先在分子功能、细胞成分和生物过程三个层面对差异表达蛋白进行GO（Gene Ontology）富集聚类分析,这些差异蛋白主要集中在能量代谢和外界物质的跨膜转运上,并参与离子转运和能量代谢途径。接着对差异表达蛋白的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路进行分析,发现N85中大部分糖酵解途径相关蛋白受到抑制,与乙醇生成相关的蛋白在YJSH1菌株中表达明显上调。（3）构建黄酒酵母菌株的CRISPR/Cas9基因组编辑实验体系。以ADE2为标记基因,利用网站CRISPR direct来设计一段20bp的g RNA序列（ATTGGGACGTATGATTGTTGAGG）。再以p CAS质粒为模板进行反向PCR,在p CAS质粒上引入g RNA序列。另在体外设计一段编辑过的DNA基因序列作为同源修复模板,通过优化G418添加浓度来确定最适抗生素筛选浓度,并采用高效的醋酸锂转化法进行转化培养,筛选获得红色的ade2突变体。本研究构建了黄酒酵母菌株的CRISPR/Cas9基因组编辑技术的实验体系,可用于后续对差异表达蛋白质的功能验证及优良黄酒酵母菌株遗传育种等研究。
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