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肝癌是我国发病率和致死率均较高的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的生命健康,迫切需要研发新型的抗癌药物以及新的治疗方法。葛根素是从传统中药葛根中提取的一种异黄酮类化合物,具有抗氧化、降血脂、抗凋亡、抗炎等广泛的药理学作用。既往动物体内实验或体外细胞实验证实葛根素可能通过改善机体自身免疫功能、提高化疗敏感性、抑制细胞增殖及促进细胞凋亡等而表现出对宫颈癌、肺癌、肾癌等具有抑制作用,但是否对肝癌具有一定的治疗作用尚未见文献报道。本研究将以人肝癌Hep G2细胞为研究对象,通过测定细胞增殖抑制率、细胞周期改变、测定细胞凋亡并计算细胞凋亡率、检测凋亡相关基因和蛋白表达,研究葛根素对肝癌细胞生长的影响并探讨其作用机制。第一部分葛根素对肝癌细胞增殖与凋亡的影响及机制研究目的:检测肝癌细胞增殖抑制率和细胞凋亡,测定凋亡相关蛋白表达变化,进而探讨分析葛根素对肝癌细胞增殖和凋亡的影响并初探其机制。方法:体外培养并取对数生长期人肝癌Hep G2细胞,设空白对照组、葛根素10μg/ml组、葛根素20μg/ml组、葛根素40μg/ml组和顺铂(40μg/ml)组。采用MTT比色法测定细胞增值抑制率,通过流式细胞术(FCM)检测细胞周期、观察细胞凋亡并计算细胞凋亡率,采用蛋白质免疫印迹(Western blotting)技术检测Bax、bcl-2、激活型caspase-3蛋白表达。结果:1.经葛根素(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)或顺铂40μg/ml干预48h能够显著提高人肝癌Hep G2细胞增殖抑制率(P<0.05或P<0.01),且葛根素对人肝癌Hep G2细胞增殖抑制率的作用具有一定的剂量依赖性。与顺铂40μg/ml组比较,葛根素40μg/ml组人肝癌Hep G2细胞增殖抑制率显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.经葛根素(20μg/ml、40μg/ml)或顺铂40μg/ml干预48h能够显著提高人肝癌Hep G2细胞处于G0/G1期的比例并显著降低处于G2/M期的比例(P<0.05或P<0.01),提示葛根素能够阻滞人肝癌Hep G2细胞有丝分裂;与顺铂40μg/ml组比较,葛根素40μg/ml组人肝癌Hep G2细胞G2/M期比例显著降低(P<0.05),而两组间G0/G1期差异无统计学意义(P>0.05)。3.经葛根素(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)或顺铂40μg/ml干预48h能够剂量依赖性地诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡。计算细胞凋亡率:葛根素(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)组人肝癌Hep G2细胞凋亡率分别为(20.98±5.75)%、(46.01±6.43)%、(71.86±8.50)%,顺铂40μg/ml组为(35.72±5.38)%,与空白对照组[(3.69±1.41)%]比较,差异均具有统计学意义(P<0.01);与顺铂40μg/ml组比较,葛根素(20μg/ml、40μg/ml)组人肝癌Hep G2细胞凋亡率显著升高(P<0.05或P<0.01)。4.与空白对照组比较,经葛根素(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)干预48h后人肝癌Hep G2细胞bcl-2蛋白表达显著下调而激活型caspase-3蛋白表达显著上调(P<0.05或P<0.01),葛根素(20μg/ml、40μg/ml)组Bax蛋白表达显著上调、Bax/Bcl-2表达比值显著升高(P<0.05或P<0.01)。与顺铂40μg/ml组比较,葛根素40μg/ml组人肝癌Hep G2细胞bcl-2表达显著下调、Bax/bcl-2表达比值显著升高、激活型caspase-3蛋白表达量显著升高(P<0.05)。小结:葛根素能够提高人肝癌Hep G2细胞增殖抑制率和凋亡率,上调Bax和激活型caspase-3蛋白表达并下调bcl-2表达;提示葛根素具有抑制人肝癌Hep G2细胞增殖并促进Hep G2细胞凋亡的作用,可能与其抑制Hep G2细胞有丝分裂及调节凋亡相关蛋白表达有关。第二部分葛根素对肝癌细胞顺铂化疗敏感性的影响及机制研究目的:通过相关指标检测,研究分析葛根素对肝癌细胞顺铂化疗敏感性的影响并初探其机制。方法:体外培养并取对数生长期人肝癌Hep G2细胞,设空白对照组、葛根素20μg/ml组、顺铂(40μg/ml)组和联合(葛根素20μg/ml+顺铂20μg/ml)组。采用MTT比色法测定细胞增值抑制率,通过FCM检测细胞周期、观察细胞凋亡并计算细胞凋亡率,采用Western blotting法测定细胞中Bax、bcl-2和激活型caspase-3蛋白表达。结果:1.经葛根素20μg/ml、顺铂40μg/ml或联合(葛根素20μg/ml+顺铂20μg/ml)干预48h均能显著提高人肝癌Hep G2细胞增殖抑制率(P<0.01);联合组与顺铂组比较,联合组人肝癌Hep G2细胞增殖抑制率显著高于顺铂组(P<0.01)。2.葛根素20μg/ml组、顺铂40μg/ml组和联合(葛根素20μg/ml+顺铂20μg/ml)组人肝癌Hep G2细胞处于G2/M期的比例显著降低(P<0.05或P<0.01),顺铂组和联合组人肝癌Hep G2细胞周期处于G0/G1期比例显著降低(P<0.05或P<0.01);联合组与顺铂组比较,联合组人肝癌Hep G2细胞周期G2/M期比例显著升高(P<0.05)。3.经FCM检测,葛根素20μg/ml组、顺铂40μg/ml组和联合(葛根素20μg/ml+顺铂20μg/ml)组人肝癌Hep G2细胞凋亡细胞数量明显增多。计算细胞凋亡率:葛根素组人肝癌Hep G2细胞率(43.46±6.09)%、顺铂组凋亡率(39.84±5.47)%、联合组凋亡率(65.19±6.71)%,与空白对照组细胞凋亡率(3.72±1.38)%比较,差异均具有统计学意义(P<0.01)。联合组与顺铂组比较,联合组人肝癌Hep G2细胞凋亡率显著高于顺铂组(P<0.05)。4.经Western blotting检测,葛根素20μg/ml组、顺铂40μg/ml组和联合(葛根素20μg/ml+顺铂20μg/ml)组人肝癌Hep G2细胞Bax、激活型caspase-3蛋白表达均显著上调而Bcl-2蛋白显著下调(P<0.05或P<0.01),Bax/Bcl-2表达比值显著升高(P<0.01)。联合组与顺铂组比较,联合组人肝癌Hep G2细胞Bax/Bcl-2表达比值和激活型caspase-3蛋白表达均显著高于顺铂组(P<0.05)。小结:葛根素可能通过抑制有丝分裂、改变细胞周期及调节凋亡相关蛋白表达而表现出提高人肝癌Hep G2细胞顺铂化疗敏感性的作用。结论:葛根素可能通过抑制细胞增殖并促进其凋亡而表现出抑制人肝癌Hep G2细胞生长以及提高人肝癌Hep G2细胞顺铂化疗敏感性的作用;其机制可能与抑制有丝分裂以及调节凋亡相关蛋白表达有关。