心脏2型兰尼碱受体（ryanodine receptor type 2,RyR2）分布于心肌肌浆网,在兴奋收缩耦联水平调控Ca2+的释放。RyR抑制剂dantrolene最初是应用于治疗临床麻醉所致恶性高热,近年来研究发现其可以通过抑制RyR2结构域变构、增强Ca2+亲和力、抑制Ca2+泄露发挥心血管保护作用,但目前的研究多局限在心力衰竭及心律失常领域。心肌肥厚是重要的心肌重构过程,是多种心血管疾病的病理基础,Ca2+失衡是心肌肥厚的核心环节,因此钙通道RyR2抑制剂dantrolene在治疗心肌肥厚方面可能具有巨大潜力。为此,我们以Ca2+依赖的信号传导通路作为中介,探究dantrolene在体内及体外环境下对心肌肥厚的作用及机制,为心肌肥厚的机制研究及精准治疗靶点的探索提供新思路和新证据。本研究共计分为三部分,第一部分在动物水平构建心肌肥厚模型,验证dantrolene的心肌肥厚保护作用。第二部分通过RNA测序分析dantrolene干预心肌组织的转录谱,找到药物下调的TNF通路。第三部分通过对心肌中Ca2+依赖的信号传导通路、TNF通路等关键蛋白表达及活性的检测,初步筛选药物干预的靶标机制,利用基因干涉技术及通路抑制剂,在苯肾上腺素诱导的心肌肥大细胞模型上,对dantrolene干预肥厚的机制进行探索和验证。第一部分:动物实验目的:明确dantrolene在动物水平对压力超负荷诱导心肌肥厚的作用。方法:将8周龄的C57 BL/6雄性小鼠随机分为假手术对照组（n=7）、假手术dantrolene组（n=7）、手术对照组（n=7）及手术dantrolene组（n=7）,通过主动脉弓缩窄术构建心肌肥厚动物模型,术后口服dantrolene（30mg/kg）或溶媒药物。4周后对小鼠进行经胸骨心脏超声检查、有创血流动力力学检测,称重计算心体比、心胫比,并将心室组织切片后进行苏木精-伊红染色、Masson染色、麦胚凝集素染色。利用qPCR及western blot的手段,对心室组织中肥厚标志物m RNA及蛋白表达量进行检测。结果:心肌肥厚模型构建成功,且dantrolene的干预明显减轻了心肌肥厚,表现为手术dantrolene组与手术对照组相比:心体比、心胫比下降,心肌组织纤维化程度减轻、心肌细胞面积减小,左室后壁厚度变薄,心肌肥厚标志物的m RNA和蛋白表达量下降。与此同时,dantrolene对血流动力学指标及心功能无影响。第二部分:组织RNA测序目的:通过对dantrolene干预心肌组织的转录组信息分析,为药物干预靶点提供依据。方法:对上述小鼠心室组织进行RNA测序,筛选出随着dantrolene的干预而上调、下调的差异表达基因（differential gene expression,DEG）。将DEGs与基因本体、KEGG-PATHWAY数据库信息进行比对,鉴定出参与dantrolene调控的关键信号传导通路。利用qPCR技术,对测序结果中显著变化的候选分子进行验证。结果:与手术对照组相比,184个DEGs在dantrolene组心肌中的表达有下调趋势,包括富集在TNF通路中的Creb3l3、IL18R1和Ccl5基因。qCR验证结果与RNA测序趋势一致。第三部分:机制探索目的:探讨在心肌肥厚体内及体外模型中,dantrolene对肥厚及炎症相关的信号通路蛋白的影响,筛选及验证可能的药物干预机制。方法:体内实验部分,利用western blot技术,检测心肌组织Ca2+依赖的Calcineurin通路、CaMKII通路的关键蛋白,检测肥厚相关的MAPKs通路、AKT通路的关键蛋白,并检测在测序结果中显著变化的TNF-α通路关键蛋白。体外实验部分,以新生大鼠乳鼠心肌细胞为对象,通过苯肾上腺素构建心肌肥大细胞模型,使用Ppp3ca过表达质粒、通路抑制剂FK506从而上调、下调calcineurin,通过western blot技术检测Calcineurin通路、MAPKs通路、AKT通路及TNF-α通路的关键蛋白。结果:Dantrolene降低了心肌组织及心肌细胞中Calcineurin通路关键蛋白表达量,减轻了MAPKs通路和AKT通路关键蛋白的表达及磷酸化,降低了TNF-α通路关键蛋白的表达及磷酸化。上述变化与FK506作用相似,可因calcineurin过表达而减弱。结论:在压力超负荷诱导小鼠心肌肥厚体内模型、苯肾上腺素诱导大鼠乳鼠心肌细胞肥大体外模型中,RyR2抑制剂dantrolene可能主要通过抑制Calcineurin/NFAT3信号途径,影响了肥厚基因转录调控,减缓炎症反应、免疫应答,进而抑制TNF-α/NF-κB/NLRP3信号通路,进而延缓心肌肥厚。