论文部分内容阅读
植物细菌性病害是一类非常重要的植物病害,世界上已经报道的植物细菌性病害有500多种,我国记录的细菌病害有150种以上。植物细菌病害病原细菌可危害农作物、蔬菜、花卉、果树、林木和药用植物等。其中由柑橘黄龙病菌(Candidatus liberibacter asiaticus)引起的柑橘黄龙病(Citrus huanglongbing,HLB)和达旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)引起的甘薯茎腐病(Stem and root rot desease of sweet potato)在中国地区爆发,造成严重的经济损失。建立快速、灵敏的检测技术是这两种植物细菌病害诊断和防控的关键。血清学检测技术操作简单、特异性好、灵敏度高,适合大规模样品检测。因此,该技术在植物细菌病害的诊断和检测中广泛应用。但目前国内外还没有具有特异性和广谱性的柑橘黄龙病菌单抗,也没有检测甘薯茎腐病菌的血清学技术报道。为此,本论文分别制备了抗柑橘黄龙病菌和抗甘薯茎腐病菌的单克隆抗体,并以单克隆抗体为核心分别建立了快速、可靠地检测这两种病原菌的血清学技术,为这两种细菌病害的诊断与检测、预测预警和科学防控提供技术支持。(1)柑橘黄龙病菌单克隆抗体的制备及应用:以感染柑橘黄龙病菌的叶脉组织粗提液作为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、细胞培养、抗体检测和细胞克隆获得了 6株能分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株(6A7、9A1、11H9、10G1、13F11和18F12)。6株杂交瘤细胞株分泌的单抗的间接ELISA效价在10-6至10-7之间,抗体类型均为IgG1,kappa轻链。Western blot试验结果显示,其中6A7、13F11和18F12单抗能与感染柑橘黄龙病的叶脉组织中大小约115kDa的蛋白发生特异性免疫反应,11H9单抗与感染柑橘黄龙病叶脉组织中大小约56kDa的蛋白发生特异性免疫反应。其他单抗的Western blot没有杂交信号,推测其针对空间构像型抗原决定簇。以制备的单抗为核心建立了检测柑橘黄龙病菌ACP-ELISA和dot-ELISA的血清学方法。建立的两种血清学方法检测感染柑橘黄龙病菌病叶呈特异性免疫反应,而与健康柑橘叶片呈阴性反应。广谱性试验结果显示,两种血清学方法均能与广西、江西、浙江以及重庆的柑橘黄龙病叶呈阳性反应。其中以6A7和10G1单抗为核心建立的ACP-ELISA方法的灵敏度较高,检测感染黄龙病菌叶脉粗提液的灵敏度均达到1:10240倍稀释(w/v,g/mL),以9A1、18F12、11H9或13F11单抗为核心建立的ACP-ELISA方法的灵敏度也可达到1:5120倍稀释;以6A7单抗为核心建立的dot-ELISA方法的灵敏度最高,检测感染黄龙病菌叶脉粗提液的灵敏度高达1:10240倍稀释(w/v,g/mL),以18F12单抗为核心建立的dot-ELISA方法的灵敏度为1:5120倍稀释,以10G1单抗为核心建立的dot-ELISA方法的灵敏度为1:2560倍稀释,而以13F11、9A1或11H9单抗为核心建立的dot-ELISA方法的灵敏度也可达到1:1280倍稀释。用建立的血清学方法检测广西、江西、浙江和重庆地区的125个柑橘样品,有83个样品感染了黄龙病菌,检测结果与PCR检测结果一致。PCR产物的核酸测序和序列比对证明血清学方法的准确性。(2)甘薯茎腐病菌单克隆抗体的制备及应用:以甘薯茎腐病致病菌FY1710菌株作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了 5株能够分泌抗甘薯茎腐病菌单抗的杂交瘤细胞株(25C4、16C10、9B1、6H4和9H10)。5株杂交瘤细胞株分泌的单抗的间接ELISA效价在10-6到10-7之间,抗体类型均为IgG1,kappa轻链。以制备的单抗为核心分别建立了检测甘薯茎腐病菌的ACP-ELISA,TAS-ELISA,dot-ELISA和Tissue blot-ELISA血清学检测方法。灵敏度分析结果表明,建立的ACP-ELISA、TAS-ELISA、dot-ELISA检测甘薯茎腐病菌的灵敏度分别高达1:107、1:108和1:108倍稀释(菌体湿重/体积,g/mL),且3种血清学检测方法与分析的非致病菌均呈阴性反应。建立的Tissue blot-ELISA方法能够特异性地检测感病甘薯植物组织中的甘薯茎腐病菌,而与健康的甘薯植物组织不发生任何免疫反应。