铜绿假单胞菌是一种分布广泛的机会致病菌,可造成多种感染,尤其易于感染囊性纤维化病人及烧伤、免疫力低下人群。由于其所具有的内源耐药性和获得性耐药性,使得对其引起的感染治疗变得越来越困难,因此对铜绿假单胞菌耐药机制的研究至关重要。绿脓杆菌素是铜绿假单胞菌合成的一种特有的细菌素。PAO1能够合成3类共5种绿脓杆菌素:R2(PA0614-PA0627),F2(PA0632-PA0648),S2(PA1150),S4(PA3866),S5(PA0985)。铜绿假单胞菌对很多抗生素都具有一定抗性。其中TMP是一种广谱抗生素,最初作为预防和治疗尿路感染的特效药单独使用。TMP是细菌二氢叶酸还原酶的抑制剂,其抑菌原理是能够干扰细菌的叶酸代谢,进而抑制细菌的生长。但由于其广泛使用,使得铜绿假单胞菌对TMP的抗性逐年增强。实验室前期在构建转座突变体库时发现铜绿假单胞菌PAO1中基因prt N(PA0610)和top A的双突变体对甲氧苄啶(Trimethoprim,TMP)表现明显的抗性。经过验证确定了TMP抗性表型来源于prt N的突变。本研究针对prt N突变造成铜绿假单胞菌对TMP抗性这一现象,探究了细菌产生TMP抗性的机制,对基因prt N与抗性之间相联系的分子通路进行了研究。研究首先构建了prt N敲除突变体,PAO1(Δprt N)对TMP的MIC增强了4倍左右。在铜绿假单胞菌中编码二氢叶酸还原酶的基因是fol A(PA0350)。研究检测了prt N突变体对fol A表达的影响,结果表明,fol A的表达水平在PAO1(Δprt N)比在PAO1中反而有所下降。由于铜绿假单胞菌的生物被膜和外排泵也会影响对抗生素的抗性,实验分别测定了生物被膜和相关外排泵的表达情况。结果表明,突变体中生物被膜没有变化,受外排泵作用的3种抗生素的敏感性也没有变化。基因prt N是一个转录调节基因,能够调控绿脓杆菌素的合成。近期有报道R型和F型绿脓杆菌素的合成可能会影响铜绿假单胞菌对抗生素的抗性,因此实验分别构建了6种绿脓杆菌素基因的突变体ΔR2,ΔF2,ΔRF,ΔS2,ΔS4,ΔS5,并测定对TMP抗性的影响。通过比较突变体与野生型的CFU和MIC,发现6种突变体并没有表现出TMP抗性。另一方面,绿脓杆菌素与其结合位点的相互作用也可能影响细菌对抗生素的抗性,我们构建了一株铜绿假单胞菌的突变体PAO1(Δwbp L),因为缺陷了A-band和B-band结构的脂多糖(LPS)而缺失了R型绿脓杆菌素的结合位点,它表现出了一定的TMP抗性。实验结果反应了绿脓杆菌素结合位点在TMP的作用过程中可能起到了一定作用。由于TMP有可能通过引发细菌内部ROS的爆发,最终导致细菌裂解死亡。对ROS相关基因ahp C,kat A,oxy R的转录水平进行了测定,结果发现kat A在PAO1(Δprt N)中的表达要远远高于野生型,初步证实了我们的假设。研究对于深入了解铜绿假单胞菌的耐药机制,探寻潜在抗感染方法提供了新的数据和基础。