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细菌活的非可培养(VBNC)状态是细菌在不良环境下形成的一种休眠方式。在所在环境改善时非可培养细胞复苏为可培养状态,但有关细菌复苏机制并不明确。藤黄微球菌(Micrococcus luteus)细胞复苏促进因子(Resuscitation promoting factor,Rpf)首次被报道能促使休眠菌状态细胞复苏,并刺激正常细胞生长。现已发现复苏促进因子(Rpf)广泛存在于高G+C含量革兰氏阳性细菌中,与细菌生长及抵御不良环境有关。不同种类细菌的Rpf种类和数量有一定差异。红球菌属的细菌广泛分布于岩石、土壤、地下水等自然环境。多数种类在修复石油污染土壤、污水处理等方面有有广阔应用前景。红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)KB1分离自石油污染土壤,具有高效石油降解能力和环境适应性。为探索Rpf在红平红球菌适应环境中的作用,本文进行了红平红球菌KB1 Rpf基因克隆、基因结构分析、表达及生物学性质研究,具体内容如下:设计了复苏促进因子基因特异引物,从红平红球菌KB1基因组DNA扩增出4种rpf基因,分别为564、1125、1128和555 bp,编码187、353、375和184个氨基酸残基的蛋白质。序列分析发现4种rpf基因分别与藤黄微球菌rpf基因,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)rpf B、rpf C及链霉菌(Streptomyces coelicolor)rpf B有较高相似性。4个rpf基因编码的蛋白都有一个类似藤黄微球菌细胞复苏促进因子的Rpf域,含有1个保守谷氨酸残基,由大约70个氨基酸组成。其中Rpf-1与结核分枝杆菌、链霉菌Rpf C相似,只含1个Rpf结构域,Rpf-2与结核分枝杆菌Rpf B相似,含有1个Rpf域、1个G5域和2个DUF348,Rpf-3与链霉菌Rpf B相似,含有1个Rpf域、G5域和3个DUF348,Rpf-4与藤黄微球菌Rpf相似,含1个Rpf域和1个Lys M域。Rpf-2、Rpf-3含信号肽序列,Rpf-1、Rpf-4不含信号肽。Rpf-1、Rpf-2、Rpf-3和Rpf-4均为亲水性蛋白,含有多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点,没有组氨酸位点。设计特异表达引物,将红平红球菌KB1 rpf-1基因克隆于原核表达载体p ET-32a(+),在大肠杆菌BL21中高效表达,用Ni琼脂糖亲和层析柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明纯化蛋白分子量为36k Da。用人工合成底物4-Methylumbelliferyl-β-D-N-N’-N’-triacetyl chitotriose检测发现rpf-1具有溶菌酶活性。溶菌酶比活力为2.07 U/mg。以偶氮酪蛋白为底物测定了纯化蛋白rpf-1的蛋白酶活性,发现纯化蛋白能水解偶氮酪蛋白,蛋白水解酶比活力为235 U/mg。将纯化的重组蛋白Rpf-1添加到不同状态红平红球菌细胞培养物中,发现其对正常生长、VBNC状态及-80℃低温保存的细胞具有明显复苏或促生长作用。添加10%的Rpf-1使低温保存红平红球菌生长速度增长4.8-6倍。添加Rpf-1使正常生长的细菌细胞在12 h时入对数期,48 h细菌数量达最大,是对照组细菌生长量的3倍。添加Rpf-1重组蛋白使VBNC状态的红平红球菌复苏量增加,48 h后细菌生长量是空白对照组的1.44倍。