细胞是生物体中最基本的结构单元和功能单元,在单细胞水平上研究细胞形态和组成可以提供关于特定微环境中单个细胞的准确信息,对于研究细胞信号转导、疾病的病理和能够早期诊断重大疾病的生物标志物等都具有重要意义。质谱成像技术（MSI）由于无需标记、多元素/分子同时检测等优势,目前被广泛用于生物样品的成像分析,特别是高空间分辨质谱成像技术近年来引起了极大的关注。结合质谱技术的固有特征与高空间分辨成像提供的精细位置信息,高空间分辨质谱成像技术可在细胞乃至亚细胞层面对生物分子进行定位,为生命科学、医学等领域的深入研究提供了一种新的工具。激光作为一种常见的微区采样技术很早就被作为离子源引入质谱当中。然而传统的激光质谱技术却由于灵敏度以及光学衍射极限的限制很难达到亚微米级的空间分辨率。为此,我们开发了一种基于原子力显微镜（AFM）控制的近场纳米有孔针尖解吸电离源（Nano-ATDI）,并将其与飞行时间质谱仪结合,研制了一台纳米有孔针尖解吸电离飞行时间质谱（Nano-ATDI-TOFMS）,实现了高空间分辨的质谱成像,并最终开展在单细胞成像方面的应用。本论文主要从仪器的搭建、成像性能初探、单细胞中药物成像和单细胞中纳米粒子成像四方面展开介绍。1.仪器的搭建研制了一台纳米有孔针尖解吸电离飞行时间质谱（Nano-ATDI-TOFMS）,该仪器由一台音叉式原子力显微镜与一台反射式飞行时间质谱仪组成。本论文从仪器的硬件设计与软件开发两方面展开详细介绍。硬件部分包括原子力显微镜系统、纳米有孔探针、激光器、飞行时间质谱仪,软件部分包括成像软件和数据处理软件。Nano-ATDI-TOFMS使用有孔针尖近场激光来减小采样光斑的直径,使用真空传输提高传输效率,同时引入后电离提高电离效率,以部分解决高分辨成像质谱所面临的技术难题,可以实现近场激光解吸电离（NDI）、基质辅助近场激光解吸电离（MANDI）以及近场激光解吸激光后电离（NDPI）在内的三种电离方式,以及形貌成像与质谱成像两种成像模式。2.Nano-ATDI-TOFMS成像性能初探首先对NDPI源的灵敏度进行了探讨:证明相比大气压采样,在真空下采样可以有效减少样品的再沉积;相比激光解吸电离,借助后电离可以极大提高电离效率,以上两点设计提高了仪器灵敏度,为单细胞成像奠定基础。接下来我们对系统的成像分辨率进行了考察:利用NDPI-MS对中性红镀层样品进行弹坑实验与成像实验,分别获得了 800 nm的横向分辨率以及860 nm的成像分辨率。由于纳米有孔光纤既是质谱离子源又是AFM扫描探针,因此Nano-ATDI-TOFMS可以实现单细胞的形貌与化学共成像,显示出该系统在单细胞层面的综合表征能力。最后利用MANDI-MS对细胞样品展开初步分析,在细胞上获得了内源物的信号,扩宽了仪器的分析范围。实验表明,本论文开发的Nano-ATDI源兼具高传输效率（真空传输）、高电离效率（单光子后电离）和高空间分辨率（近场激光）,同时作为AFM的一种变体还拥有形貌成像能力,在单细胞成像方面展现出巨大的分析潜力。3.Nano-ATDI-TOFMS用于单细胞中药物成像了解细胞内药物的药理作用以及潜在的毒理对于新药的开发和评估至关重要,但是由于缺乏单个细胞内药物和代谢物的时空分布信息,目前这些主题的研究仍然面临巨大挑战。在本论文中,我们通过Nano-ATDI-TOFMS对药物在细胞内的分布展开研究。采用NDPI源以250 nm/pixel对两种结构相似的药物原黄素和依沙吖啶进行了单细胞质谱成像。不同浓度原黄素喂药细胞的MSI结果显示,原黄素在细胞中的分布存在浓度依赖,并且呈现区域性累积,荧光成像结果证实原黄素通过ion-trapping的机理聚集在溶酶体内。依沙吖啶喂药细胞的MSI结果显示,尽管依沙吖啶与原黄素结构类似,但其在细胞内的分布却与原黄素存在较大差异,这提醒我们即使结构类似的化合物在细胞内也可能存在不同的作用位点与作用机理。此外,依沙吖啶的质谱与荧光成像结果还揭示了其进入细胞之后可能的表型变化和荧光变化,突出了分析方法化学特异性的重要性。实验结果表明Nano-ATDI-TOFMS为表征单个细胞内药物分布及其表型变化,加速鉴定和评估新开发药物提供了一种新思路、新方法。4.Nano-ATDI-TOFMS用于单细胞中纳米粒子成像纳米颗粒（NPs）已在医药领域中得到了广泛应用。由于NPs的治疗效果与其在细胞内的位置密切相关,以高空间分辨技术研究NPs在细胞内的分布至关重要。在本论文中,我们通过Nano-ATDI-TOFMS对NPs在细胞内的分布展开研究。采用NDI源以250 nm/pixel对AuNPs和AgNPs培养的细胞进行单细胞质谱成像,同时开展了质谱与荧光共成像实验,用于对AuNPs进行定位和验证质谱成像结果的准确性。另外除了 NPs外,实验还可以同时获得NPs表面配体的成像。Nano-ATDI-TOFMS结合了近场技术的高空间分辨率优势以及质谱技术高特异性和多物质同时检测的能力,为NPs特别是功能化NPs在细胞水平的研究提供了新的途径。