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犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一种急性传染病,以出血性肠炎与心肌炎为主要临床特征,此病发病率、死亡率均较高,常呈大范围爆发性流行。本病的治疗主要通过给患犬注射CPV高免血清。当前贵阳市主要流行的CPV毒株为CPV-2a亚型,当前临床上所用的抗CPV血清主要由CPV-2亚型毒株研制,虽在一定程度上提高了对犬细小病毒病的治愈率,但治疗失败的现象也很普遍。为了探索本研究中的血清对目前贵阳市犬细小病毒病的治疗效果开展本实验,为以后犬细小病毒病的治疗提供基础数据。1.犬细小病毒2a亚型VP2蛋白的原核表达与纯化以实验室保存的CPV-2a亚型VP2基因重组克隆质粒为模板,通过双酶切将其定向插入到原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达载体构建p ET-32a-VP2。将p ET-32a-VP2转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,摸索最佳IPTG诱导浓度、诱导时间、诱导温度等表达条件,通过SDS-PAGE电泳检查结果。结果表明,经过IPTG诱导的重组菌株可表达出大小为64 ku的His-VP2重组蛋白;1 m M IPTG、37℃、诱导5 h为其最佳表达条件;重组蛋白主要以包涵体的形式存在。将表达的His-VP2重组蛋白用亲和层析镍柱挂柱,以不同浓度(50 mmol/L、400 mmol/L)咪唑进行洗脱,进行蛋白纯化。SDS-PAGE电泳结果表明,纯化的重组蛋白在64 ku大小处出现无杂带的目的条带;经Western Blottting检测,在64 ku处出现单一的目的条带。2.抗犬细小病毒2a亚型VP2蛋白免疫血清的制备将纯化的His-VP2重组蛋白经过透析复性,BCA法测定浓度后与弗氏佐剂等体积乳化制备亚单位疫苗(BCA法测出蛋白浓度约为500μg/m L),采用皮下多点注射的方式免疫5只健康犬,共免疫3次,每次免疫剂量为1 m L(蛋白含量约为250μg),并于每次免疫后13 d抽取犬全血进行ELISA抗体浓度、特异性Western Blottting鉴定。ELISA抗体检测结果显示:免疫犬1、2、3、5在二免后13天抗体水平均相对最高,免疫犬4在三免后13天抗体水平均相对最高,5只犬均在抗体最高时进行免疫血清的大量制备;血清作为一抗经Western Blottting检测VP2蛋白约在64 ku处出现单一的目的条带,说明血清具有良好的特异性。3.免疫血清疗效研究将临床上采集的犬细小病毒经离心滤菌后同步接种于猫肾细胞并盲传三代,待细胞病变(CPE)达90%后收毒,经过HA、PCR方法进行鉴定;采用Reed-Muench法测定病毒TCID50。结果表明CPV的血凝效价为29、TCID50为107.42/100μL、PCR成功扩增出CPV NS1基因,大小为2 007 bp。按1 m L/kg的毒量以口服方式对健康犬进行人工感染CPV实验,在犬发病后,用制备的免疫血清对犬进行治疗,同时设立商品化血清作为对照,用量均为1 m L/kg,统计治愈率。结果显示犬攻毒后均发生呕吐、拉稀等临床症状;自制血清治疗组的3只治疗犬中死亡了1只,治愈了2只;商品化血清治疗组的3只治疗犬中死亡2只,治愈1只,相比之下自制血清较商品化血清对CPV患犬的治愈率较高。