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目的:通过microRNA干扰技术沉默Livin基因,检测人卵巢浆液性乳头状腺癌顺铂耐药细胞SKOV3/CDDP对顺铂耐药性的体外变化。探讨靶向Livin基因microRNA干扰对逆转卵巢癌顺铂耐药的可行性,为临床寻找卵巢癌治疗新方法提供理论依据。方法:1体外复苏、培养人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞SKOV3及耐药细胞SKOV3/CDDP,并连续传代,于倒置显微镜下观察细胞形态。2四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测顺铂对人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞SKOV3及耐药细胞SKOV3/CDDP的IC50,计算人卵巢癌耐药细胞SKOV3/CDDP的耐药指数。3设计合成靶向Livin基因的microRNA序列,并连接到质粒载体上,该载体表达绿色荧光。用脂质体转染法转染人卵巢浆液性乳头状腺癌耐药细胞SKOV3/CDDP。于转染24小时后观察细胞形态和荧光细胞数,并计算转染效率。4四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测利用microRNA干扰技术沉默Livin基因后,卵巢浆液性乳头状腺癌耐药细胞SKOV3/CDDP在不同顺铂浓度(1ug/ml、5ug/ml、10mg/ml)及不同作用时间(12h、24h、28h)下的细胞增殖情况。应用流式细胞术检测转染前后SKOV3/CDDP细胞在浓度为1ug/ml顺铂作用24h后凋亡率的变化。结果:1顺铂对卵巢浆液性乳头状腺癌耐药细胞SKOV3/CDDP的IC50为22.96mg/L ,卵巢浆液性乳头状腺癌亲本细胞SKOV3的IC50为6.87mg/L。卵巢浆液性乳头状腺癌耐药细胞SKOV3/CDDP的耐药指数=22.96/6.87=3.29,此耐药指数介于3和4之间,可进行耐药试验。2光镜与荧光显微镜显示:靶向Livin基因的microRNA序列转染SKOV3 /CDDP细胞24小时后,空白对照组细胞生长密集,光泽度好,转染组及阴性转染组可见细胞密度略小于空白对照组,细胞光泽度下降,荧光显微镜下见部分贴壁细胞呈绿色荧光。转染后48小时,空白对照组细胞传代良好,转染组及阴性转染组细胞贴壁率下降,荧光显微镜下可见呈现绿色荧光的贴壁细胞数增多,约占细胞总数70%-80%,证明转染成功。转染72小时后,荧光显微镜下观察转染组及阴性转染组,可见呈现绿色荧光的细胞数开始减少,120小时后荧光显微镜下只见到零星呈绿色荧光的细胞。说明本实验利用脂质体转染法成功将设计合成靶向Livin基因的microRNA序列转染了人卵巢浆液性乳头状腺癌耐药细胞SKOV3/CDDP,但由于脂质体转染法自身具有的缺点,使得转染持续时间较短,通过荧光显微镜观察可知,将靶向Livin基因的microRNA利用脂质体转染法转染人卵巢浆液性乳头状腺癌耐药细胞SKOV3/CDDP,在72小时内是有效的,因此后续试验均在转染后72小时内完成。(见Fig4-7)3四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测结果显示:在顺铂浓度为1ug/ml时,转染组细胞在12h、24h、48h吸光度分别为0.56±0.060,0.69±0.056,1.04±0.200,均低于阴性转染组及空白对照组吸光度,且有统计学意义(P<0.05)。在顺铂浓度为5ug/ml时,转染组细胞在12h、24h、48h吸光度分别为0.40±0.027,0.50±0.002,0.700±0.062,均低于阴性转染组及空白对照组吸光度,且有统计学意义(P<0.05)。在顺铂浓度为10ug/ml时,转染组细胞在12h、24h、48h内吸光度分别为0.31±0.033,0.38±0.031,0.56±0.074,均低于阴性转染组及空白对照组吸光度,且有统计学意义(P<0.05)。说明在不同顺铂作用浓度及作用时间下,转染组细胞增殖抑制率均明显增加,且与阴性转染组及空白对照组吸光度比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(阴性转染组及空白对照组间吸光度无明显统计学差异)。(见Table2-4)4流式细胞术检测结果:浓度为1ug/ml顺铂作用于细胞24h后,转染组细胞凋亡率为24±3.296%,阴性转染组及空白对照组凋亡率分别为8.03±0.354 %、7.11±0.644%,转染组与阴性转染组、空白对照组凋亡率比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。(阴性转染组及空白对照组间吸光度无明显统计学差异)。(见Table5)结论:体外培养试验中,microRNA干扰技术能够沉默卵巢浆液性乳头状腺癌耐药细胞SKOV3/CDDP中的Livin基因,并能够有效降低卵巢浆液性乳头状腺癌耐药细胞SKOV3/CDDP对顺铂的耐药性。提示Livin基因表达改变可能与卵巢癌细胞耐药相关,microRNA干扰技术沉默Livin基因可能是逆转卵巢癌耐药的一种有效途径。本实验只是初步探讨,应进一步进行体内试验研究,以使结论更具有说服力。