目的采用Opti Prep密度梯度离心结合免疫磁珠负向筛选法富集循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC),并联合多色免疫荧光标记和荧光原位杂交技术检测CTC,建立一种简易高效的富集和鉴定癌症患者外周血CTC的方法,有效应用于临床肿瘤患者外周血的CTC计数检测。在此基础上,进一步探索建立单细胞捕获技术平台,对特定CTC细胞或者CTC细胞群进行单细胞组学的研究。显微镜观察到CTC后进行显微切割和显微吸取以获取单细胞进行分子鉴定,这一研究将促进CTC的分子鉴定,开发新的治疗靶点,并产生对癌症患者更有效的治疗方案。方法1.利用不同密度细胞的沉降系数不同,配比不同浓度的Opti Prep溶液梯度离心分离外周血各细胞成分,验证单核细胞聚集细胞层。分别选取QGY-7701等多种肿瘤细胞混入外周血,模拟体内循环肿瘤细胞状态。比较Opti Prep液与Ficoll液富集肿瘤细胞的效率、回收率、活性率。密度梯度离心结合免疫磁珠建立最优的循环肿瘤细胞富集体系。2.选取5种肿瘤细胞株:肝癌细胞(QGY-7701、Huh-7、SMMC-7721)、卵巢癌细胞HO-8910、肺癌细胞A549分别进行CD45和CK18两种抗体的细胞免疫荧光染色,CIK细胞作对照。FISH标记CIK细胞染色体数目。将肿瘤细胞混入正常人外周血模拟外周血循环肿瘤细胞进行富集,免疫荧光技术结合FISH检测,准确识别肿瘤细胞。3.联合富集和检测方法精确检测癌症患者的外周血循环肿瘤细胞,进行方法学验证评估。并根据患者CTC检测数目和临床预后数据分析我们建立的CTC检测对于肿瘤患者预后判断的作用。4.尝试显微切割和显微吸取提取单个靶细胞及较纯的目的细胞群,应用Carl Zeiss PALM Combi System和Cell Ector Plus两大系统捕获单个细胞,并进行RT-PCR检测肿瘤细胞的基因表达情况。结果1.Opti Prep液能有效分离单核细胞,将QGY-7701肿瘤细胞富集于白膜层。肝癌细胞(QGY-7701、Huh-7、SMMC-7721)、卵巢癌细胞HO-8910、肺癌细胞A549在Opti Prep中肿瘤细胞的富集效率均高于Ficoll,两组间差异均有统计学意义(P<0.05)。单细胞操作取50个左右肿瘤细胞入血模拟循环肿瘤细胞,比较Opti Prep与Ficoll的回收率较一致。2.免疫荧光结果显示,仅CIK细胞观察到CD45红色荧光,而CK18则是仅CIK细胞无绿色荧光。荧光原位杂交结果表明能显著标记细胞染色体,以此识别染色体异常细胞。3.通过对33例入组患者外周血的检验验证以上富集和检测循环肿瘤细胞的方法,均发现有循环肿瘤细胞的存在,说明建立的这一方法能有效检出癌症患者血液中的CTC。实验结果显示,CTC数量较多对应较短生存期,较差预后。4.本研究根据实验需要,涉及两种可识别荧光标记的单细胞获取技术,结果显示均能迅速准确的得到单个目的细胞,解决细胞异质性问题,获取纯净靶细胞,进而为少量CTC的下一步分子鉴定提供了机会,显示了良好的应用前景。结论本研究成功建立了Opti Prep密度梯度离心结合免疫磁珠负向筛选法富集CTC,并联合多色免疫荧光标记结合荧光原位杂交技术检测CTC,有效应用于临床肿瘤患者外周血的CTC鉴定。另外,尝试单细胞捕获新技术获取稀有循环肿瘤细胞,为后续单细胞目的基因表达鉴定和进一步的基因测序研究探寻方向,为癌症的预后及预测信息指明方向、为个体化指导治疗和用药的合理选择提供参考。