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随着能源供求之间的矛盾日益尖锐以及环境污染的问题不断加重,寻找石化燃料的可替代生物能源越来越受到人们的关注。乙醇是目前广泛使用的生物燃料,但它有很多缺点,例如能量密度低;高吸水性导致的运输和储存问题。相反,异丁醇气压低,容易与汽油混合;能量密度接近汽油;不需要特殊的适应装置等优势而受到人们的青睐。异丁醇生物合成过程中需要还原性辅因子NADPH,而厌氧条件下,糖酵解过程中主要生产NADH,所以在异丁醇生产菌中存在还原力不平衡的问题。本研究采用两种不同的策略来优化胞内辅因子供求之间的平衡,以满足异丁醇生产的需要。第一种策略是通过引入乙醇合成途径消耗掉过剩的NADH,同时激活磷酸戊糖途径来增加NADPH的供给。在AS108中恢复乙醇合成途径后,厌氧发酵条件下,异丁醇的转化率由0.66mol/mol下降到了 0.29mol/mol。通过调控乙醇脱氢酶基因adhE,发现乙醇合成能力与异丁醇的合成能力呈负相关,弱化AdhE的酶活后,异丁醇的转化率由0.29 mol/mol提高到了 0.6 mol/mol。当调控葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf激活磷酸戊糖途径后,异丁醇的转化率由0.29 mol/mol提高到了 0.41 mol/mol。对这两个基因组合调控后,得到最好的菌株ZL021的异丁醇的产量为53 mM,异丁醇的转化率为0.74 mol/mol,分别比初始菌株AS108提高了 51%和12%。ZL021总的糖醇转化率为0.81 mol/mol 比 AS108 提高了 23%。第二种策略是用NADH型的乙酰羟基酸还原异构酶(KARI)代替原有的NADPH型的IlvC,以提高对NADH的利用效率。在AS108中替换掉KARI酶后,再对异丁醇合成途径中的各个基因逐一进行RBS文库调控,最终获得的菌株ZL114,厌氧发酵144小时,生产83mM的异丁醇,糖醇转化率为0.85 mol/mol,与AS108相比,分别提高了 137%和29%。通过敲除不同种类的醇脱氢酶,发现NADPH型的醇脱氢酶对生产异丁醇的作用较大,相比ZL114,敲除后异丁醇的产量下降了 40%。继而对转氢酶基因pntAB进行调控,以增加NADPH的供给,最终菌株ZL116的异丁醇产量达到了 137mM,转化率为0.88 mol/mol,相比出发菌AS108,分别提高了 290%和33%。通过这两种改造策略,缓解了产异丁醇大肠杆菌中还原力不平衡的问题,获得了一株遗传稳定,异丁醇产量较高的菌株。