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布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌感染引起的一种人兽共患传染病,严重威胁着畜牧养殖业和人类健康。近十多年来,布病在我国全面流行,并造成重大损失,开展对布病的防控和净化工作刻不容缓。准确检测是布病防控和净化的重要环节,血清学检测是布病最常用检测方法,其中酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法兼具高效、灵敏、特异性强等特点,目前已成为布病检测的主要方法之一。基于单克隆抗体开发的竞争ELISA方法具有更高灵敏度和特异性,以及能对不同动物进行布病检测的优势,使其应用日益广泛。具有良好特异性和敏感性的布鲁氏菌特异性单克隆抗体是开发竞争ELISA试剂盒的前提。本研究以布鲁氏菌S1330灭活全菌作为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾脏细胞与SP2/0细胞按5:1比例进行细胞融合。使用布鲁氏菌不同毒株,包括S1330株、2308株、16M株、RM57株,以及大肠杆菌O:157,小肠结肠炎耶尔森菌O:9分别作为筛选抗原,建立了间接ELISA筛选方法。经3次亚克隆后,筛选获得到1株能稳定分泌布鲁氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6E4。该单抗与光滑型布鲁氏菌S1330株、2308株、16M株均有特异性反应,与粗糙型布鲁氏菌RM57株、大肠杆菌O:157,小肠结肠炎耶尔森菌O:9无交叉反应。进一步应用免疫蛋白质组的方法,筛选该单抗识别的抗原及其表位。布鲁氏菌全菌裂解蛋白经双向电泳后,与单克隆抗体6E4株进行蛋白质免疫印迹(Western-blot),挖掘差异蛋白质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析和蛋白预测,共获得7个可能与6E4单抗反应的布鲁氏菌蛋白,分别标注为:L11、L12、L13、L14、K11、K12、K13。根据Genbank上公布的参考序列,设计7个蛋白编码基因的引物,并通过PCR获得了相应基因的DNA片段。将各PCR产物分别克隆进表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化。采用单克隆抗体6E4对纯化的蛋白进行Western-blot鉴定。结果显示,L12、L13、L14与单克隆抗体6E4无特异性反应;K11、K12、K13、L11均与单克隆抗体6E4出现反应杂交带,其中K11反应性最强。4个阳性蛋白均列为可疑抗原,有待进一步验证。本实验筛选出一株光滑型布鲁氏菌特异性单克隆抗体,预测并表达出7个蛋白抗原,初步确定其中4个蛋白抗原与单克隆抗体具有特异性反应。已完成的工作为开发具有良好特异性和敏感性的布鲁氏菌竞争ELISA试剂盒奠定了基础。