茶叶浸提物对功能性酶活性和二级结构的影响研究

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本文研究了绿茶、铁观音、红茶和六堡茶浸提物及茶多酚对血管紧张素转化酶(ACE)、胰脂肪酶(PPL)和胰α-淀粉酶(PPA)等三种功能性酶活性的影响,并选取PPL和PPA,研究其与茶源物质相互作用后紫外差示光谱、荧光猝灭光谱和圆二色谱的变化。首先比较了紫外可见光法和高效液相色谱法对研究茶多酚ACE活性的适用性,得出一种直接进样、等梯度洗脱便能达到良好分析效果的RP-HPLC测定方法。以马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)为反应底物,ACE为催化剂,反应所生成的马尿酸为测定指标,未加酶抑制剂的反应为空白对照。使用Intersil ODS-3色谱柱(4.6mm i.d.×250mm,5μm),柱温35℃,流动相为甲醇-超纯水(体积比35:65,各含0.05%(v/v)三氟乙酸及0.1%(v/v)三乙胺),流速0.8 mL/min,检测波长228nm。在马尿酸浓度为5-50μg/mL时,马尿酸浓度与其峰面积呈良好的线性关系(R2=0.9997),马尿酸的回收率为93.55%-101.50%,相对标准偏差(RSD)为2.95%。采用此法测得绿茶茶多酚对ACE具有一定的抑制作用,抑制率随着茶多酚浓度的升高呈现先升高再降低的总体趋势,最大的抑制率为29.44%,此时茶多酚浓度为2mg/mL。其次研究了茶多酚对PPL和PPA活性的影响。结果表明其对PPL和PPA均有显著的抑制作用,茶多酚对PPL和PPA的半抑制浓度IC50分别为1.23和0.82mg/mL,为可逆性抑制,可逆抑制反应的类型均为非竞争性抑制,抑制常数Ki分别为2.49和1.08mg/mL。通过茶浸提物对PPA抑制活性的研究发现,绿茶、铁观音、红茶和六堡茶浸提物的半抑制浓度IC50分别为8.99,8.89,7.90和40.8mg/mL。抑制动力学结果表明四种茶浸提物对PPA的抑制反应均为可逆抑制,可逆抑制的抑制类型均为非竞争性抑制,抑制常数Ki分别为:11.59,10.37,9.52和43.29mg/mL。紫外差示光谱结果表明,不同浓度的茶多酚和茶浸提物均能引起PPL和PPA紫外吸收光谱的变化,光谱谱峰升高,峰位红移,浓度越高,变化幅度越大。四种茶浸提液相比,红茶的影响程度最大,六堡茶最小。以278nm和295nm波长光进行激发,研究了四种茶浸提物和茶多酚与PPL和PPA相互作用后的荧光猝灭光谱,结果显示随着茶源物质浓度的增加,PPL和PPA的荧光发射强度逐渐降低,峰位发生红移。结合Stern-Volmer方程,推断四种茶浸提液和茶多酚对PPL和PPA的荧光猝灭均为以非共价键结合的某种不发光的配合物引起的静态猝灭。通过圆二色谱技术,研究了四种茶浸提液对PPL和PPA圆二色谱及二级结构的影响,结果显示四种茶浸提物均能促使PPA和PPL双负峰往单一负峰转变,茶叶发酵程度越低,即茶多酚的含量越高,转变越明显,峰高变化也越显著。与茶浸提物相互作用后PPA和PPL均变现出α-螺旋含量降低,而β-折叠含量增多,此种结构变化与酶的失活具有相关性。
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