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临床上,患者进行造血干细胞移植及大剂量放化疗后,体内较长时期血小板减少且恢复较慢。其中,巨核细胞损伤导致的血小板减少,除输注血小板外,尚缺乏有效的治疗手段,并且随着血小板输注的增多,也增加了输血相关感染性疾病和潜在性的移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)的发生。巨核细胞发育以及血小板的生成是一个复杂的生物学过程,包括造血干细胞发育为巨核祖细胞(megakaryocytic progenitors cell, MKPC),MKPC又进一步分化和成熟为MK,并释出血小板。研究者发现利用造血干/祖细胞进行定向诱导分化、体外扩增巨核细胞,再将扩增的巨核细胞输注给患者,可能有助于解决骨髓移植后血小板恢复较慢的临床问题,减少血小板的输注。造血基质细胞作为造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)的主要成分,可以分泌多种细胞因子,促进巨核细胞增殖分化、成熟产板。因此,从修复或重建骨髓造血微环境正常功能入手治疗巨核细胞损伤,是一个值得探索的领域。以往对基质细胞的研究多集中在人骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells,hBMSCs),但是由于hBMSCs的数量及增殖分化潜能随年龄增加而下降、采集骨髓增加供者痛苦和风险,另外由于自体移植中患者自身造血微环境异常,而异体移植又存在组织相容性等诸多问题,限制了hBMSCs在临床上的广泛运用。人脐血中的造血干细胞较外周血和骨髓更原始,具有来源广泛,采集方便,免疫原性弱和长期造血重建的特点,已成为新的造血干细胞来源。那么,在人脐血中是否存在着造血基质细胞?以及其具体的生物学特点有待探究。课题组长期从事人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs)及脐血造血微环境的研究,首次发现并证实人脐血中存在基质细胞的前体细胞,能通过特定的细胞因子组合使hUCBDSCs得以有效扩增;以hUCBDSCs为滋养层的体外扩增体系对脐血CD34~+细胞具有明显的扩增作用,可促进巨核细胞集落生成单位(CFU-Meg)的形成;体内试验中,hUCBDSCs促进小鼠辐照后CFU-Meg形成和血小板恢复的作用明显优于hBMSCs。对于上述hUCBDSCs能够促进巨核细胞发育这一生物学现象,本室在国内外杂志上已经做了详尽的报道,但是对于这一生物现象的具体机制尚不清楚。血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是巨核细胞发育以及血小板成熟的重要诱导因子,有关TPO调控巨核细胞发育和血小板生成的研究也有系列报道,但有研究发现TPO治疗后存在产生抗凝血抗体、加重出血等危险。另有文献报道,TPO-/-小鼠体内巨核祖细胞虽然减少,但是残留的巨核细胞和血小板在形态和功能上并没有受到损害,并且基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor,SDF-1)仍然可以促进残余血小板的成熟和释放。Dhanjal和Wu两个实验室于2007年先后发现,PECAM-1-/-小鼠体内巨核细胞无法沿SDF-1浓度梯度迁移,最终导致其成熟障碍。SDF-1主要由基质细胞分泌产生,属于趋化因子CXC亚家族,在造血干/祖细胞的增殖、分化、迁移和归巢中发挥重要作用。那么在巨核细胞发育过程中是否存在着SDF-1/PECAM-1调控轴?其具体机制又是什么?基于此,我们提出“高表达SDF-1人脐血源基质细胞在PECAM-1协同下促进巨核细胞增殖、迁移”这一假设。本课题在构建巨核细胞/hUCBDSCs共培养模型的基础上,以SDF-1/PECAM-1为切入点,观察hUCBDSCs体外促进巨核细胞增殖和迁移的作用;围绕PECAM-1的上下游蛋白/信号通路,深入探讨hUCBDSCs促进巨核细胞发育的可能机制,有望为临床上运用hUCBDSCs治疗巨核细胞损伤、促进血小板恢复这一新的细胞治疗手段提供理论依据和实验基础。方法:1.人脐血源基质细胞(hUCBCSCs)共培养影响巨核细胞PECAM-1的表达实验培养hUCBDSCs和HEL细胞;建立Transwell HEL细胞/hUCBDSCs共培养模型;ELISA检测hUCBDSCs分泌SDF-1的情况;CCK-8检测人脐血源基质细胞hUCBDSCs对HEL细胞增殖的影响;细胞迁移实验检测人脐血源基质细胞hUCBDSCs对HEL细胞的迁移的影响;RT-PCR检测HEL细胞PECAM-1在mRNA水平的表达;免疫荧光组化和Western blot检测HEL细胞PECAM-1的蛋白表达水平。2. SDF-1/PECAM-1在巨核细胞发育中的机制探讨分两部分:第一节,SDF-1/PECAM-1慢病毒RNAi载体的构建siRNA的设计,vshRNA载体的构建,慢病毒包装,慢病毒感染靶细胞,RNAi的效率检测。第二节,SDF-1/PECAM-1在巨核细胞增殖迁移中的机制探讨SDF-1和PECAM-1分别敲低后,RT-PCR、Western blot检测HEL细胞中PECAM-1的表达变化;SDF-1和PECAM-1分别敲低后,RT-PCR、免疫荧光组织化学检测HEL细胞中CXCR4的表达变化;CCK-8检测RNAi后HEL细胞的增殖变化情况;细胞迁移实验检测RNAi后细胞迁移情况;Western blot检测SHP-2蛋白(Src homology 2 domain-containing tyrosine phosphatase)的表达;Western blot检测PI3K/Akt,MAKP/ERK两信号通路中Akt,ERK磷酸化蛋白的表达变化。结果:1.镜下观察人脐血源基质细胞和HEL细胞。ELISA检测到hUCBDSCs,较之hBMSCs,能表达较高量的SDF-1,特别是在第7天细胞融合时分泌量达到峰值,约3.5ng/ml;hUCBDSCs对HEL细胞的趋化作用强于hBMSCs(p<0.05);在和hUCBDSCs共培养后HEL细胞增殖加快,在第4天和第7天时,其增殖的OD值均高于对照组(p<0.05);从RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色实验结果得到,hUCBDSCs共培养促进HEL细胞的PECAM-1的表达。2.利用RNAi的理论和方法制备出靶向SDF-1和PECAM-1基因的两个慢病毒载体,经RT-PCR、Western blot检测两个载体工作正常,能有效敲低目的基因。3. SDF-1/PECAM-1在巨核细胞增殖迁移中的机制探讨3.1 HEL细胞和hUCBDSCs共培养后,其PECAM-1在mRNA水平和蛋白水平均表达上调,当hUCBDSCs敲低SDF-1后,其作为滋养层细胞再和HEL细胞共培养,导致HEL细胞PECAM-1表达下调;另一面,当HEL细胞的PECAM-1敲低后,再和正常的hUCBDSCs共培养,其表面的PECAM-1表达仍然下降;3.2不论是mRNA水平还是蛋白水平,HEL细胞的PECAM-1的敲低并不会影响其CXCR4的表达(p>0.05);3.3 HEL细胞和hUCBDSCs共培养后,hUCBDSCs对HEL细胞的增殖和迁移作用均增强(p<0.01)。而当hUCBDSCs的SDF-1敲低后,共培养后hUCBDSCs对HEL细胞的增殖和迁移均受到抑制(p<0.01);另一方面,当HEL细胞的PECAM-1敲低后,再进行共培养后,HEL细胞的增殖和迁移也同样受到了抑制(p<0.01);3.4 HUCBDSCs共培养后增强HEL细胞SHP-2的表达;而SDF-1和PECAM-1的敲低抑制HEL细胞SHP-2蛋白的表达;3.5 HUCBDSCs共培养后增强HEL细胞Akt和ERK的磷酸化;而SDF-1和PECAM-1的敲低抑制HEL细胞Akt和ERK的磷酸化。结论:1. HUCBDSCs,较之hBMSCs,能分泌较高水平的SDF-1,促进巨核细胞PECAM-1的表达;2.在巨核细胞/人脐血源基质细胞共培养体系中,存在着SDF-1/PECAM-1联合信号调控,从而促进巨核细胞的增殖和迁移;3. SDF-1/PECAM-1联合通过激活pI3K/Akt,MAKP/ERK信号通路,促进巨核细胞的增殖和迁移。