随着人们生活水平的提高和世界人口的老龄化,心血管疾病特别是血栓性疾病已成为威胁人类健康和生命的重要疾病。血栓性疾病包括急性心肌梗塞、缺血性脑血管病、肺栓塞以及各种动静脉血栓等,每年可导致全世界大约2600万人死亡。统计资料显示,在我国血栓性疾病的每年发病人数达1000万,其中病死人数100万,至少有300万人次需要溶栓药物进行治疗,是一类高发病率、高致残率、高死亡率疾病。尽管已有的第一代、特别是第二、三代溶栓药物在临床治疗中已经发挥了重要的作用,但其存在各自的局限性,仍不能降低居高不下的血栓性疾病的发病率和致死率,因此研究和开发新型、高效的溶栓药物具有重要意义。 PAI-1(Plasminogen activator inhibitor,PAI-1)是纤溶系统的重要组成成分,其主要生理功能是通过抑制t-PA和u-PA来调节纤溶系统与凝血系统的动态平衡,是纤溶系统的负调控因子。大规模流行病学调查和临床研究表明,PAI-1升高是形成冠心病和心肌梗塞等血栓性疾病的一个独立危险因素。是血栓前状态的重要分子标志物,而且与其他动脉粥样硬化危险因素如肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、糖尿病等密切相关。以PAI-1作为靶基因,为心血管疾病特别是血栓性疾病的防治提供了一条新的思路,从抑制PAI-1表达入手有可能研制出新型抗栓、溶栓药物。而反义技术为心血管疾病特别是血栓性疾病的防治提供了新的技术平台。 可用于抑制基因表达的反义技术包括三类:反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASONs),包括反义脱氧寡核苷酸(ASODNs)和反义RNA;具有催化活性的核酶(ribozymes)及DNA酶(DNA zymes);小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。其基本原理是,根据碱基互补配对规律设计出能与靶基因特定区域结合的RNA或DNA片段,通过各种机制使其降解或抑制其编码蛋白的翻译,从而抑制目的基因的表达。反义技术为基因组学研究以及新型基因药物靶标的筛选提供了全新的策略并展示了广阔的前景。 RNA是研发基因药物的理想分子靶标,mRNA结构靶点筛选是研发反义mRNA基因药物的基础。本研究应用以PAI-1为靶基因,应用全长基因寻靶技术:即主要通过克隆PAI-1全长基因、体外转录为mRNA、与寡核苷酸库杂交、芯片杂交及原位RNase H切割的方法,进行mRNA结构靶点筛选,筛选出靶向PAI-1 mRNA反义核酸有效序列;在此基础上设计、合成有高潜在活性的siRNA,在细胞水平进行验证并探讨其溶栓作用机制研究。本课题对新型溶栓基因治疗药物的筛选具有重要的理论价值和现实指导意义。 实验分以下二个部分:1.应用全长基因寻靶技术筛选靶向PAI-1mRNA的ASODN有效序列;2.靶向PAI-1 mRNA siRNA有效序列的筛选与细胞学验证。1.应用全长基因寻靶技术筛选靶向PAI-1mRNA的ASODN有效序列