左归丸、右归丸对β-catenin、Runx2调控BMSCs成骨分化及其甲基化的影响

来源 :陕西中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wyy_9715072
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目的:本实验研究左归丸、右归丸SD大鼠含药血清在成骨诱导环境中的不同时间点干预诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中,成骨靶基因β-catenin(β-链蛋白)、Runx2(成骨特异性转录因子2)的表达情况及其甲基化水平情况。以此阐明“肾主骨”的物质基础(主要)为骨髓间充质干细胞;功能基础(主要)为靶基因β-catenin、Runx2甲基化调控成骨分化,为治疗骨质疏松、骨坏死等疾病提供新的方法,也为中医“肾主骨”理论的创新提供新的思路。  方法:以3周龄(40g±5g) SD大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,采用贴壁筛选法和密度梯度离心法相结合的方法进行体外分离、纯化、培养骨髓间充质干细胞。通过细胞形态学观察及流式细胞技术的方法鉴定BMSCs。在对BMSCs进行传代纯化的基础上,制备左归丸、右归丸SD大鼠含药血清进行干预诱导,以成骨基因β-catenin、Runx2为靶基因,采用实时荧光定量PCR(Real time RT-PCR)、甲基化特异性PCR(MSP)等核心实验技术检测在成骨诱导条件下干预7天后(3天的实验研究前期已完成),观察靶基因β-catenin、Runx2的表达情况及其甲基化规律。  结果:(1)通过对体外分离培养的骨髓间充质干细胞进行流式细胞技术鉴定,细胞表面标记物为CD29阳性,CD90阳性,CD34阴性,CD45阴性,表达BMSCs表面标记物而不表达其它造血系干细胞等的标记物,符合骨髓间充质干细胞特性,证实所研究的细胞为来源于骨髓的骨髓间充质干细胞。(2)在成骨诱导环境中,含药血清干预7天后,经Real time RT-PCR检测,结果为:左归丸组、右归丸组诱导β-catenin基因的表达明显高于正常对照组、成骨诱导组,组间比较差异明显(P<0.05)。左归丸组、右归丸组诱导的Runx2基因的表达明显高于正常对照组、成骨诱导组,组间比较差异明显(P<0.05)。(3)在成骨诱导环境中,含药血清干预7天后,经甲基化特异性PCR检测,结果为:左归丸组、右归丸组β-catenin基因甲基化率明显低于成骨诱导组、正常对照组,组间比较差异明显(P<0.05)。β-catenin基因甲基化程度依次为右归丸组<左归丸组<成骨诱导组<正常对照组。左归丸组、右归丸组Runx2基因甲基化率明显低于成骨诱导组、正常对照组,组间比较差异明显(P<0.05)。Runx2基因启动子区域甲基化程度依次为左归丸组<右归丸组<成骨诱导组<正常对照组。  结论:(1)左归丸、右归丸具有促进成骨的作用。(2)左归丸、右归丸通过上调骨髓间充质干细胞成骨基因β-catenin、Runx2的表达,起促进BMSCs向成骨方向分化的作用。(3)左归丸、右归丸通过调控骨髓间充质干细胞成骨基因β-catenin、Runx2启动子区域低甲基化的表观遗传学机制,起促进BMSCs成骨方向分化的作用。
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