论文部分内容阅读
目的:利用RNAi(RNAinterference)干扰技术,构建MUC4-ShRNA慢病毒稳定表达的人胰腺癌BxPC-3细胞株,观察MUC4基因沉默后于体内、外对人胰腺癌BxPC-3细胞生长、迁移的影响。方法:(1)以MUC4基因为靶点设计8条SiRNA序列,针对8段靶序列设计相应编码ShRNA发夹结构DNA模板链,并构建MUC4-ShRNA慢病毒表达载体,应用Quantitative real-time PCR (qPCR)外源性筛选有效靶点。(2)体外研究:将筛选出的MUC4-ShRNA慢病毒表达载体转染人胰腺癌BxPC-3细胞,构建为人胰腺癌BxPC-3细胞沉默MUC4基因的细胞稳转株,应用qPCR和Western blot检测稳转细胞株中MUC4基因的转录水平及蛋白含量表达的情况;应用CCK-8检测检测细胞增殖及凋亡;Transwell检测稳转株细胞的侵袭能力。(3)体内试验:将稳转细胞株归类为三种:空白对照质粒空转染组(UETP,NC组),MUC4基因沉默组(A1000141,KD组)以及对照组人胰腺癌BxPC-3细胞组(CON组)。建立人胰腺癌裸鼠异位移植瘤模型,每只裸鼠皮下注入5×10~6个细胞,每组数量为12只。不同时间点测量肿瘤体积大小及大体观察肝脏及远处转移,并统计各组移植瘤数目及转移率。(4)在肿瘤细胞种植后,分别于第1、2、3、4、5、6、7、8周,每组随机选取1或2只裸鼠,对该移植瘤块进行MRI扫描,观察各个时期瘤块的信号改变,以及瘤块体积改变。结果:(1)成功构建8条SiRNA序列,编码相应ShRNA发夹结构DNA模板链并测序,测序结果与实验设计符合。(2)MUC4-ShRNA慢病毒稳定表达细胞株筛选成功,qPCR外源性验证筛选靶点的有效性,A1000141组对目的基因表达有显著的敲除作用,为最佳靶点。(3)体外实验qPCR和Western blot的结果显示,转染MUC4-ShRNA慢病毒表达载体组中MUC4的基因转录水平和蛋白表达水平均明显降低;CCK-8及Transwell的实验结果显示:KD组能抑制细胞增殖和迁移。(4)人胰腺癌的裸鼠异位移植瘤模型构建成功,空白对照质粒空转染组(UETP,NC组),MUC4基因沉默组(A1000141,KD组)以及对照组人胰腺癌BxPC-3细胞组(CON组)每组裸鼠数量12只,分别于7-10天左右成瘤,成瘤率均为100%(36/36)。MUC4基因沉默组(A1000141,KD)肿瘤的体积以及重量均低于对照组。KD组未见肝脏或远处转移病灶。与对照组比较有统计学差异。(5)裸鼠人胰腺癌细胞异位移植瘤的MRI表现:在人胰腺癌细胞种植后第1周移植瘤瘤块在T1WI序列上呈均匀等信号,于FIESTA及T2WI上呈均匀高信号。第2-3周,与第1周表现相似。从第4-10周发现瘤块T1WI呈等信号,瘤块内见斑点、片状低信号(液化坏死区域),T2WI呈高信号。随着肿瘤块体积的增大,坏死区域不断增加。3组移植瘤块MRI信号表现未见明显差异。结论:(1)应用MUC4-ShRNA慢病毒表达载体干扰人胰腺癌BxPC-3细胞,能稳定、特异及高效地抑制MUC4基因的转录和表达,并抑制人胰腺癌细胞的增殖、迁移能力,促进人胰腺癌细胞的凋亡。提示MUC4基因在胰腺癌的发生发展中起着重要作用,抑制MUC4基因的表达可能成为一种治疗胰腺癌的方法。(2)MRI可以用于对人胰腺癌细胞裸鼠异位移植瘤的体积、信号改变及生长过程进行无创的观察。