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奶牛健康养殖和抗病营养是提高我国奶牛养殖水平、改善奶品质和增强市场竞争力的新型支撑技术。奶牛乳腺炎是危害奶牛养殖业的主要疾病,不仅造成经济损失,而且危害动物和人类健康。金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌,可长期定植于乳腺组织,感染率很高。抗生素在控制细菌感染方面发挥重要作用,但是,随着耐药菌株特别是多重耐药菌株的不断出现,抗生素耐药问题已经成为影响人类健康和奶牛养殖业健康发展的重要因素。因此,研究奶牛健康养殖和抗病营养,有必要研究引起乳腺炎的病原菌。本研究对奶牛乳腺炎源121株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)和97株凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase Negative Staphylococci,Co NS)进行抗生素耐药谱和苯唑西林耐药研究。采用以DNA测序为基础的spa和多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术对121株S.aureus进行分子分型研究。进而分析菌株对大环内酯类(Macrolides)、林可酰胺类(Lincosamides)、链阳菌素类(Streptogramins)抗生素(MLS)的耐药表型和基因型。最后,对121株S.aureus携带的整合子/基因盒进行分析和研究。结果如下:1.研究发现121株S.aureus中,有113株苯唑西林敏感(MSSA),1株mec A阳性且苯唑西林耐药(MRSA),7株mec A和mec C阴性但苯唑西林耐药(MRSA)。普遍产生耐药的抗生素有氨苄西林/青霉素(80.2%),卡拉霉素(68.6%),庆大霉素(67.8%)和四环素(43%)。其中,19株S.aureus对1类抗生素产生耐药,23株对2类抗生素耐药,27株对3类抗生素耐药,31株对4类抗生素耐药,8株对5类抗生素耐药,66株表现多重耐药(对2类以上抗生素产生耐药)。有46株菌对青霉素/氨苄西林/卡那霉素/庆大霉素/四环素产生联合耐药。2.奶牛乳腺炎源97株Co NS共分为9种不同的葡萄球菌。其中,1株mec A阳性且苯唑西林耐药的表皮葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis,MRSE)和1株mec A阳性但苯唑西林敏感的溶血葡萄球菌(oxacillin-susceptible mec A-positive Staphylococcus haemolyticus,OS-MRSH)。菌株普遍产生耐药的抗生素有氨苄西林/青霉素(93.8%),卡拉霉素(72.2%),庆大霉素(64.9%)和四环素(63.9%)。有11株Co NS对1类抗生素产生耐药,24株对2类抗生素耐药,30株对3类抗生素耐药,19株对4类抗生素耐药,8株对5类抗生素耐药,57株Co NS表现为多重耐药(对2类以上抗生素耐药)。有44株Co NS对青霉素/氨苄西林/卡那霉素/庆大霉素/四环素产生联合耐药。3.S.aureus分子分型结果表明,spa分型为t524的有63株,t11772型31株,t4207型15株,t521型5株,t11771型3株,t11807型4株。同时,出现4种MLST的分型结果,主要为ST71和ST2738,分别67株和45株,其余两种为ST2683型4株,ST97型5株。t11772,t11771和t11807是新的spa型,ST2683和ST2738是新的MLST型。121株S.aureus含有12种spa-MLST基因型组合,其中t11772-ST2738,t11807-ST2683和t11771-ST2738是新发现的菌株,分别有27株,4株和3株。4.8株MRSA均为t524-ST71基因型。SCCmec分型共出现IVa和V型两种SCCmec结构,MRSA为IVa型,OS-MRSH为V型。但是,1株MRSE菌株不能确定其含有的SCCmec型别。5.40株S.aureus(33.1%)和65株Co NS(67%)产生红霉素耐药。其中,分别有95%和61.5%的菌株为诱导型耐药(i MLS),5%和30.8%的菌株为固有型耐药(c MLS)。但是,只有7.7%的Co NS菌株为MS耐药表型。所有葡萄球菌都含有一种以上MLS类抗生素耐药基因。另外,抗生素敏感菌株也含有一些MLS类抗生素耐药基因。6.121株S.aureus整合子/基因盒研究表明,I型整合子的检出率达100%,其中103株S.aureus含基因盒。所有菌株都不含有II型和III型整合子。对基因盒进行克隆和测序分析显示:陕西地区奶牛乳腺炎源S.aureus存在12种耐药基因盒,分别编码氨基糖苷类抗生素(aad A24,aad A5,aad A2,aad A4,aad A1,aac A4,aad B),甲氧苄啶(dhfr V,dfr A12,dfr A1),氯霉素(cml A6)和季胺类消毒防腐剂(qac H)耐药。共出现11种基因盒的不同排列和组合类型(A-K),其中D类dfr A1-aad A1(44.6%,54/121),K类aad A2(31.4%,38/121),G类dfr A12-hypothetical protein-aad A2(27.3%,33/121)和A类aad A1(25.6%,31/121)基因盒排列类型流行最为广泛。这些数据说明,I型整合子/基因盒在陕西地区奶牛场流行比较普遍,菌株是否携带I型整合子及耐药基因盒与其耐药表型有密切关系,且主要介导氨基糖苷类抗生素耐药性的产生和散播,而四环素类,青霉素类和MLS类抗生素的耐药表型与是否携带I型整合子及耐药基因盒没有相关性。综上所述,本课题系统研究了奶牛乳腺炎致病性葡萄球菌的分子分型和耐药谱。初步解析了整合子在耐药基因产生和散播中发挥重要作用。为临床合理使用抗生素,奶牛健康养殖和抗病营养的进一步研究奠定理论基础。