论文部分内容阅读
长期以来,霉菌毒素污染严重威胁畜禽健康养殖和人类健康。其中,脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）是目前农产品及饲料中污染率和超标率最高的一种霉菌毒素,而猪是对DON暴露最敏感的农场动物。DON对猪的生长、健康具有极大危害,肠道是其作用的主要靶器官之一,然而,目前关于DON对猪肠道毒性的分子机制研究不够深入。为了探究猪抵御DON诱导肠道损伤的分子机制,本研究以猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）为研究模型,首先利用1 μg/mL浓度DON对IPEC-J2细胞进行诱导48 h,结合一系列细胞表型和基因表达水平测定,以期建立体外研究DON诱导IPEC-J2细胞损伤的研究模型。其次,利用m6A-MeRIP测序技术对DON诱导前后的IPEC-J2细胞进行m6A修饰图谱分析,筛选重要候选基因及信号通路;然后,利用RNA干扰、过表达以及细胞表型检测筛选与系统验证DON诱导IPEC-J2细胞损伤的关键m6A甲基化修饰酶,在此基础上,一方面利用MeRIP-qPCR、点突变、双荧光素酶以及western blot分析关键甲基化酶对靶基因m6A修饰及其表达水平的作用,另一方面利用RIP-qPCR以及表达验证深入探究关键甲基化酶依赖m6A识别蛋白对靶基因的表达调控机制;最后,分析靶基因介导信号通路对DON诱导IPEC-J2细胞凋亡的影响。主要实验结果如下:1.利用1 μg/mL浓度DON对IPEC-J2细胞进行诱导感染48 h,并通过间接免疫荧光IFA、CCK8细胞活性、细胞周期、细胞凋亡、活性氧（ROS）、抗氧化酶（CAT、SOD）、凋亡相关基因（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2）以及细胞因子（IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α）等指标测定,结果显示,DON诱导后,细胞形态发生明显改变,并且骨架蛋白（α-Tubulin）分布显著下降;细胞活性出现极显著下降（P＜0.01）,降低了 44.1%;细胞凋亡率出现极显著上升（P＜0.01）,促凋亡基因Caspase-3、Bax表达水平出现极显著上调（P＜0.01）,抗凋亡基因Bcl-2表达水平极显著下调（P＜0.01）;ROS水平出现显著上升（P＜0.05）;抗氧化相关基因（CAT、CuZn-SOD、Mn-SOD）表达水平均极显著下调（P＜0.01）。由此表明,1μg/mL DON感染48 h可以明显诱导IPEC-J2发生细胞损伤,可以作为DON诱导IPEC-J2细胞损伤的体外研究模型。2.利用m6A-MeRIP测序,对DON诱导前后的IPEC-J2细胞进行m6A甲基化图谱比较分析,结果发现,DON组和对照组中存在共同的10,473个m6A峰和5649个m6A修饰基因,DON组特有m6A修饰基因1617个;存在1个典型m6A修饰的GGACU模块;大约30%转录组基因（2321/7970）存在1个特定的m6A修饰峰,大部分基因（5077/7970）存在1-3个m6A修饰峰;Metagene分布显示,大部分m6A修饰发生在基因的起始密码子、编码区和终止密码子,与饼图统计结果相一致;DON组中发生高甲基化修饰的m6A峰2156个,而低甲基化修饰的m6A峰1715个,DON组上调m6A峰修饰基因主要富集在TNF、TGF-β和NF-κB等信号通路中;DON组上调差异表达基因（DEGs）728 个,下调 DEGs 1048 个,上调 DEGs 主要富集在 TNF、NOD-like receptor和MAPK信号通路;m6A甲基化修饰与差异表达基因联合分析显示,差异m6A甲基化水平与mRNA表达水平存在极显著的正相关（R=0.93,P＜0.0001）,m6A甲基化修饰和未发生m6A甲基化修饰的整体基因表达水平存在显著差异（P＜0.05）,编码区发生m6A修饰的基因表达水平极显著低于终止密码子区域修饰的基因（P＜0.01）,由此表明m6A甲基化修饰可以显著影响基因表达水平。m6A高度甲基化修饰与DON组上调基因表达有关,网络互作、通路注释以及表达验证表明,TRAF2及其介导TNF-α信号通路可能作为DON诱导IPEC-J2细胞损伤过程中关键分子。3.检测不同 m6A 修饰酶（WTAP、METTL3、METTL14、ALKBH5、FTO）在DON诱导细胞前后差异表达,METTL3 mRNA和蛋白表达在DON诱导后变化最为明显;间接免疫荧光检测显示,METTL3主要定位在细胞核中,并且DON诱导后表达分布明显增加;METTL3表达下调可以极显著提高细胞增值活性（P＜0.01）,细胞凋亡水平显著下降（P＜0.05）,过表达后细胞凋亡水平极显著上升（P＜0.01）,METTL3表达对凋亡相关基因（Bcl-2、Caspase-3、Bax）mRNA及蛋白表达水平均造成显著影响（P＜0.05）。此外,METTL3表达下调可以极显著降低细胞ROS水平（P＜0.01）,METTL3表达上调可以显著提高细胞ROS水平（P＜0.01）,同时METTL3下调显著提高抗氧化指标（CAT、GPXs、CuZn-SOD）表达水平（P＜0.05）,由此表明METTL3作为DON诱导IPEC-J2细胞损伤的关键m6A甲基化修饰酶。4.首先利用qRT-PCR、western blot以及间接免疫荧光（IFA）检测METTL3对TRAF2基因表达水平的影响,结果显示,DON诱导IPEC-J2细胞后METTL3、TRAF2均出现上调表达,METTL3干扰后,TRAF2在IPEC-J2细胞中表达分布明显降低;利用MeRIP-qPCR、点突变、双荧光素酶活性以及western blot验证显示,METTL3干扰后,TRAF2 m6A修饰水平极显著降低（P＜0.01）,mRNA及蛋白表达水平显著下调（P＜0.05）;METTL3过表达后,TRAF2 m6A修饰水平极显著上升（P＜0.01）,mRNA及蛋白表达水平显著上调（P＜0.05）;针对TRAF2基因m6A位点修饰区域,METTL3干扰后,TRAF2基因m6A位点野生型（WT）转录活性极显著下降（P＜0.01）,而TRAF2基因m6A位点突变型（MUT）转录活性无显著差异（P＞0.05）。western blot验证METTL3可以识别TRAF2 m6A位点降低其蛋白表达,由此表明,METTL3介导m6A修饰对TRAF2转录和蛋白表达均造成显著影响。5.本研究利用1 μg/mL浓度DON对IPEC-J2细胞进行诱导感染48 h,并结合qRT-PCR和western blot验证表明,YTHDF1 mRNA和蛋白表达均出现明显的上调（P＜0.01）,YTHDF1干扰及过表达后,TRAF2 mRNA和蛋白表达均出现显著变化（P＜0.05）,METTL3依赖YTHDF1促进TRAF2蛋白表达;利用RNA免疫共沉淀（RIP）技术验证发现,YTHDF1蛋白与TRAF2存在明显的结合关系;双荧光素酶活性检测显示,YTHDF1识别TRAF2 m6A修饰位点提高其转录活性,由此表明METTL3依赖m6A识别蛋白YTHDF1促进TRAF2转录翻译。6.首先利用间接免疫荧光、RNA干扰以及细胞流式等验证TRAF2表达对DON诱导细胞凋亡的影响,结果显示,DON诱导后TRAF2在IPEC-J2细胞中表达分布明显增加;TRAF2干扰后,DON诱导细胞凋亡水平明显下降（P＜0.01）,凋亡相关基因（Caspase-3、Bax、Bcl-2）mRNA和蛋白表达水平均显著变化（P＜0.05）;DON诱导组TRAF2、JNK、p-JNK均出现上调表达。加入JNK抑制剂（SP600125）后,DON组和对照组p-JNK出现明显的下调表达,并且凋亡蛋白Caspase-3出现下降,Bcl-2蛋白表达出现上升;TRAF2干扰后p-JNK表达分布明显降低。其次,TRAF2干扰后,JNK和p-JNK蛋白表达下调,加入OE-METTL3过表达载体后出现明显上升回补现象;TRAF2干扰后,促凋亡蛋白Bax出现下调,抗凋亡蛋白Bcl-2出现上调,Caspase-3无明显变化,加入OE-METTL3过表达载体后Bax出现明显上升回补现象,而Bcl-2出现下降;由此表明,METTL3通过提高TRAF2表达来激活JNK信号通路,进而促进DON诱导的细胞凋亡水平上升。综上,本研究建立了 DON诱导猪IPEC-J2细胞损伤的体外研究模型,并揭示了METTL3依赖Reader蛋白YTHDF1识别TARF2 m6A修饰位点,提高了 TRAF2基因转录与翻译水平,进而激活JNK信号通路来调控DON对IPEC-J2细胞的毒性作用。本研究从RNA修饰层面为呕吐毒素毒理过程的分子调控提供新见解,并为呕吐毒素生物防控提供潜在的分子靶点。