第一部分负载肝癌干细胞RNA树突状细胞疫苗诱导的抗肝癌免疫应答研究　　 背景：　　 原发性肝细胞癌(简称肝癌，HCC)是一种预后很差的恶性肿瘤。尽管肝癌的手术，化疗，放疗等治疗方法不断取得进展，但是肝癌治疗效果仍然很不理想，术后容易复发和转移，肝癌患者的5年生存率＜10％。要提高肝癌的治疗效果，急需寻找新的有效抑制肝癌复发的治疗策略。　　 肝癌术后容易复发的原因之一是肝癌中存在肿瘤干细胞。肿瘤干细胞(CSCs)是一群具有干细胞特性的细胞，能够自我更新并分化生成普通肿瘤细胞。肿瘤干细胞和肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤干细胞理论认为传统治疗手段无法根治肿瘤的原因就是治疗后残存的肿瘤干细胞经过若干年休眠之后重新增殖，导致肿瘤复发。因此，靶向杀伤肝癌干细胞治疗是抑制肿瘤复发的一种新的治疗策略。　　 树突状细胞(DCs)是体内最重要的抗原递呈细胞。DC疫苗能够诱导抗肿瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，并已经被广泛应用于包括肝癌在内的多种肿瘤的免疫治疗中。最近，有报道证实负载恶性胶质瘤干细胞抗原的DC疫苗，能够诱导特异性抗胶质瘤干细胞的免疫反应。这说明负载肿瘤干细胞抗原的DC疫苗可作为一种新的靶向杀伤肿瘤干细胞的免疫治疗方法。然而目前还未见应用负载肝癌干细胞RNA的DC疫苗用于治疗肝癌的研究报道。　　 以往的研究证实，CD133+肝癌细胞具有较强的克隆形成能力和增殖能力，在动物体内有很强的成瘤能力。基于以上的研究结果，我们设想负载肝癌干细胞RNA的DC疫苗可能能够诱导特异性抗肝癌的免疫反应，不仅能够杀伤普通肝癌细胞，而且能够杀伤肝癌干细胞，达到抑制肝癌复发的目的。　　 目的：　　 制备负载CD133+肝癌干细胞RNA的DC疫苗，并研究其在体内外诱导抗肝癌干细胞免疫应答的作用，寻找一种增强抗肝癌树突状细胞疫苗的新途径，为临床制备更有效，更特异的DC抗肝癌疫苗奠定实验基础。　　 方法：　　 1、采用免疫磁珠分选法(MACS)或者流式细胞仪分选法从Huh7肝癌细胞系中分选纯化CD133+肝癌干细胞，然后在体内外进行鉴定；　　 2、提取CD133+Huh7细胞的总RNA；　　 3、从外周血单核细胞诱导生成未成熟DCs，同时收集T淋巴细胞备用；　　 4、用CD133+Huh7 RNA负载DCs，采用OK-432刺激DCs成熟，制备负载CD133+Huh7RNA的DC疫苗(CD133+Huh7-DCs)；　　 5、流式细胞仪检测CD133+Huh7-DCs表面共刺激分子的表达；　　 6、利用MTS检测CD133+Huh7-DCs刺激自身T淋巴细胞增殖的能力；　　 7、用LDH释放法检测CD133+Huh7-DCs诱导的CTLs杀伤肝癌干细胞的作用检测；　　 8、CD133+Huh7-CTLs对肝癌模型小鼠体内抑瘤实验分析；　　 9、ELISA法检测CD133+Huh7-DCs分泌IL-12的能力；　　 10、用流式细胞仪检测CD133+Huh7-DCs诱导的T淋巴细胞中CD8+CTLs比例和分泌IFN-γ的能力。　　 结果：　　 1、不同肝癌细胞株CD133的表达水平不同，Huh7细胞系的CD133+细胞比例在50％-60％左右。　　 2、从肝癌细胞系纯化的CD133+肝癌细胞具有较强的克隆形成能力和成瘤能力，具有肝癌干细胞的特性。　　 3、负载了RNA的成熟DCs高表达HLA-ABC,HLA-DR,CD80,CD86,CD83等抗原递呈相关分子　　 4、CD133+Huh7-DCs、Huh7-DCs和mDCs均能够有效刺激T淋巴细胞活化扩增。　　 5、在体外实验中，CD133+Huh7-CTLs不仅能够杀灭CD133+Huh7细胞，而且能够杀伤CD133-Huh7细胞；CD133+Huh7-CTLs对CD133+Huh7的杀伤能力比Huh7-CTLs，DCs-CTLs强。　　 6、与Huh7-CTLs，DCs-CTLs相比，CD133+Huh7-CTLs能够更明显地抑制Huh7细胞在裸鼠体内成瘤。　　 7、CD133+Huh7-DCs，Huh7-DCs，mDCs分泌IL-12的能力没有区别。　　 8、CD133+Huh7-DCs，Huh7-DCs和DCs活化的CTLs中CD8+细胞比例和分泌IFN-γ的CD8+T细胞的比例之间均没有差异。　　 结论：　　 1、 CD133+肝癌细胞具有肝癌干细胞特性。　　 2、CD133+Huh7-DCs诱导的CTLs在体外具有更强的杀伤CD133+肝癌干细胞的能力，并能够更有效地抑制Huh7细胞在裸鼠体内成瘤。　　 3、CD133+Huh7-CTLs抑制肿瘤生长的能力可能与其靶向杀伤CD133+肝癌干细胞有关。　　 4、我们的研究为负载肝癌干细胞RNA的DC疫苗抗肝癌治疗提供实验依据，为临床靶向杀伤肝癌干细胞的免疫治疗奠定实验基础。　　 第二部分EDIL3的表达和肝癌患者预后的关系　　 目的：　　 EDIL3(EGF-like repeats and discoidin I-like domains3)是由血管内皮细胞分泌的一种糖蛋白，它和正常血管生成密切相关，并参与肿瘤的血管生成。EDIL3在一些肿瘤细胞中高表达，在肝癌细胞和内皮细胞的相互作用中起重要作用。但目前尚未有关于EDIL3在肝癌组织中表达情况及其与肝癌患者预后关系的报道。为了确定EDIL3在肝癌中的作用，在本研究中，我们检测了EDIL3在肝癌组织中的表达情况，并分析EDIL3的表达水平与肝癌患者临床参数和预后的关系。　　 方法：　　 1、我们通过定量qRT-PCR的方法检测24对新鲜肝癌组织和癌旁正常组织中EDIL3 mRNA的表达水平；　　 2、用Western blotting检测24对新鲜肝癌组织和癌旁正常组织中EDIL3蛋白的表达水平；　　 3、免疫组织化学染色的方法检测101例肝癌组织中EDIL3蛋白的表达水平。并分析EDIL3的表达与肝癌患者临床参数及预后的关系。　　 结果：　　 1、定量RT-PCR检测结果显示EDIL3 mRNA在肝癌组织的表达水平低于相应癌旁正常肝组织的表达水平(p=0.0028，n=24)。　　 2、Westem blotting结果显示所有的肝癌组织和癌旁正常组织均表达EDIL3，24对标本中有9对肝癌组织中EDIL3的表达水平低于对照的癌旁正常组织，占37.5％.　　 3、免疫组化结果显示在101例中有95例有EDIL3的表达，占94.06％，6例阴性，占5.94％。按照评分标准，有49例高表达EDIL3，占48.5％，52例低表达，占51.5％。　　 4、统计分析表明肝癌组织中EDIL3蛋白表达与肝癌临床病理参数无关　　 5、Kaplan-Meier生存分析显示EDIL3高表达的肝癌患者预后较差，多因素Coxs分析显示EDIL3表达水平是肝癌患者独立的预后因素。　　 结论：　　 大部分肝癌和癌旁正常肝组织表达EDIL3，在部分肝癌患者中，肝癌组织的EDIL3表达水平低于癌旁正常组织。肝癌组织中EDIL3的表达水平高的患者预后比较差。我们的研究结果提示EDIL3是肝癌预后的一个独立预测指标，也是一个潜在的抗血管生成治疗靶点。我们的研究结果为深入研究EDIL3在肝癌发生发展中的作用奠定基础。