目的:肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是各种原因所致的肝脏慢性疾病的共同病理过程,是慢性肝病发展为肝硬化的早期和必经阶段,抑制甚或逆转肝纤维化向前发展极为重要。肝纤维化的形成涉及多种细胞、细胞因子及肝组织内细胞外基质的变化。核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)是一种广泛存在于体内多种细胞的核转录因子,与机体的免疫和炎症反应及凋亡调控密切相关,Bcl-2家族是它的下游基因,在细胞凋亡的基因调控过程中起着至关重要的作用,Bcl-2家族成员构成比例决定细胞存亡。姜黄素(curcumin)是从姜黄属中药分离出的主要药理活性成分,具有抗炎、抗脂质过氧化、抗肿瘤、保肝等多种药理作用。近来研究发现,血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI)对肝纤维化具有明显抑制作用。本实验通过检测CCL4诱导的小鼠肝纤维化模型肝组织中NF-KB及相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达,研究姜黄素和依那普利单独应用和联合应用对肝纤维化的影响,探讨这些指标在肝纤维化发生中的机制,并为肝纤维化的治疗提供新的靶点。方法:8周龄雄性昆明种小鼠45只随机分为5组,正常对照组(5只)、模型组(10只)、姜黄素治疗组(10只)、依那普利治疗组(10只)和姜黄素联合依那普利治疗组(10只)。除正常对照组外,各组小鼠均给予四氯化碳5ul/g体重腹腔注射建立肝纤维化模型,每周2次,共10周。姜黄素治疗组、依那普利治疗组和姜黄素联合依那普利治疗组(以后简称联合治疗组)小鼠分别从第二周到第十周给予姜黄素100ug/g、依那普利10mg/kg、及姜黄素100ug/g联合依那普利10mg/kg体重,每周3次灌胃处理,正常对照组给予蒸馏水灌胃,每周3次。所有小鼠均于10周处死。留取血清检测肝功能ALT、AST和血清肝纤维化指标HA;留取部分肝组织,10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,苏木精-伊红(HE)染色及Masson染色观察肝组织病理学改变,免疫组织化学染色方法检测IKB、NF-kBP65、Bcl-2、Bax的含量,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测肝组织Bcl-2、Bax mRNA的表达。结果:1小鼠一般情况:正常组小鼠精神好,活动自如,毛发有光泽,每周体重增长正常。模型组小鼠随着四氯化碳注射时间的延长,变得易激惹,精神萎靡,食欲下降,体重增长慢或不增,各治疗组小鼠的情况优于模型组。模型组、姜黄素治疗组、依那普利治疗组、联合治疗组、对照组小鼠体重依次为:34.43±4.08、43.38±4.75、43.56±2.88、49.75±3.62、53.60±3.51。10周末,与正常对照组相比,其他四组小鼠体重下降,差异有统计学意义(P值均<0.05)。与模型组比较,其他四组小鼠体重增加明显,差异有统计学意义(P值<0.05);对照组及联合治疗组小鼠体重高于姜黄素治疗组和依那普利治疗组(P<0.05);姜黄素治疗组与依那普利治疗组间、对照组与联合治疗组间小鼠体重比较无显著差异(P >0.05)。2小鼠血清学指标检测:实验动物血清ALT水平,模型组、依那普利治疗组、姜黄素治疗组、联合治疗组、正常对照组水平,依次为:155.29±21.56U/L,92.11±16.89U/L,83.75±14.54U/L,47.50±9.17U/L,26.60±5.22U/L。对照组及各治疗组血清ALT水平均低于模型组(P<0.05),联合治疗组效果优于依那普利及姜黄素单药治疗组(P<0.05),依那普利治疗组与姜黄素治疗组间血清ALT水平无显著差异(P >0.05);血清AST水平,模型组、依那普利治疗组、姜黄素治疗组、联合治疗组、正常对照组,依次为:205.29±15.86U/L,123.22±10.47U/L,98.38±12.41U/L,79.88±9.83U/L,65.20±16.41 U/L,各组之间AST水平的两两比较均有统计学意义,P<0.05;模型组、依那普利治疗组、姜黄素治疗组、联合治疗组、正常对照组,实验动物血清HA水平依次为:1680.22±94.19ng/ml,869.89±110.53ng/ml , 608.71±120.74ng/ml , 396.13±78.17ng/ml ,144.20±37.09ng/ml,各组之间HA水平的两两比较均有统计学意义,P <0.05。3肝组织病理学检测3.1肝组织大体标本形态:正常对照组小鼠肝脏为红褐色,柔软,明亮有光泽;模型组小鼠肝脏大体色泽暗淡,表面欠光滑,体积较正常对照组减小,肝脏边缘变钝,质地较实,肝脏表面可见散在黄色脂肪颗粒;依那普利治疗组、姜黄素治疗组小鼠肝脏大体色泽偏暗,体积较正常对照组略有减小,联合治疗组小鼠肝脏红褐色,有光泽,体积未见明显缩小。3.2肝组织病理HE染色:正常对照(G0)组小鼠肝组织结构清晰,肝小叶结构正常,肝细胞索排列规则有序,肝细胞大小均匀,无变性、坏死;模型组(G3-G4)小鼠多数正常小叶结构破坏或消失,由汇管区和中央静脉伸出粗大胶原纤维条索分割,包绕肝小叶,肝细胞索排列紊乱,肝细胞浊肿明显,坏死出血较多,纤维间隔内有大量炎性细胞浸润,部分可见假小叶形成;依那普利治疗组和姜黄素治疗组(G2-G3)可见汇管区有少量的纤维组织增生,未见假小叶形成,可见炎症细胞浸润,肝细胞水肿较模型组减轻;联合治疗组(G1-G2)优于依那普利治疗组和姜黄素治疗组。3.3肝组织病理Masson染色:显微镜下观察绿色胶原纤维分布情况,正常对照组(S0)仅于血管周围可见少量绿色纤维,细且短,肝小叶结构正常,未见纤维增生;模型组(S3-S4)肝脏组织中纤维明显增多,分布广泛,可相互连接形成较粗大的纤维间隔,多位于汇管区和血管周围;依那普利治疗组及姜黄素治疗组(S2-S3)可见较细的绿色纤维走行于血管周围;联合治疗组(S1-S2)纤维化程度较依那普利治疗组及姜黄素治疗组轻。4肝组织免疫组织化学染色4.1肝组织bcl-2蛋白免疫组织化学染色:与空白阴性对照比较,以细胞和组织棕黄色染色或深棕黄色为阳性表达。在正常小鼠肝窦、肝细胞浆和中央静脉呈低水平表达,在模型组小鼠肝组织中分布广泛,主要表达在汇管区、纤维间隔、肝窦、肝细胞膜、中央静脉和肝细胞浆也有一定表达。五组bcl-2表达量:联合治疗组(1.31±0.51)%>姜黄素治疗组(1.17±0.41)%>依那普利治疗组(0.97±0.25)%>模型组(0.70±0.36) %﹥正常对照组(0.58±0.34)%,两两比较,P <0.05,差异具有统计学意义。4.2肝组织Bax蛋白免疫组织化学染色:与空白阴性对照比较,以细胞和组织染为棕黄色染色视为阳性表达。Bax在正常小鼠中央静脉及其周围的肝窦呈低水平表达。在肝纤维化模型小鼠肝组织中主要表达在肝细胞浆,主要为变性的肝细胞浆,严重时可呈弥漫性分布,其次在肝窦、纤维间隔和中央静脉。五组bax表达量:模型组(1.52±0.20)%>依那普利治疗组(0.88±0.27)%>姜黄素治疗组(0.85±0.31)%>联合治疗组(0.63±0.22)%>正常对照组(0.25±0.20)%,两两比较,P <0.05,差异具有统计学意义。4.3肝组织NF-κBp65蛋白免疫组织化学染色:NF-κBp65阳性物质呈棕黄色颗粒,弥漫分布于细胞质中,激活后位于细胞核中。在对照组小鼠肝组织中较少表达NF-κB p65,模型组则有较强的表达,主要分布于肝细胞、HSC细胞,胞浆内亦有表达,各治疗组NF-κB p65表达较对照组有所增加,且阳性表达主要位于肝细胞浆中,各组水平依次为:模型组(2.20±0.10)%>依那普利治疗组(1.18±0.13)%>姜黄素治疗组(0.95±0.07)%>联合治疗组(0.62±0.06) %>正常对照组(0.42±0.06)%。两两比较,P <0.05,差异具有统计学意义。4.4肝组织IKB蛋白免疫组织化学染色:IκB在肝组织中的表达与NF-κB p65相似,在对照组小鼠肝组织中肝细胞浆内有较弱的表达,细胞核内无表达;在模型组及各治疗组中肝细胞浆及胞核中可见弥漫性棕黄色颗粒表达,联合治疗组以胞浆表达增多为主,胞核及HSC中也见阳性表达,而模型组胞浆及胞核中表达均较联合组明显减少,各组水平依次为联合治疗组(2.20±0.14)%>姜黄素治疗组(1.35±0.12)%>依那普利治疗组(1.08±0.07)%>模型组(0.94±0.13)%>对照组(0.50±0.06)%。两两比较,P <0.05,差异具有统计学意义。5肝组织RT-PCR检测5.1肝组织bcl-2mRNA表达:联合治疗组、姜黄素治疗组、依那普利治疗组、模型组、对照组,bcl-2mRNA表达水平明显下降:联合治疗组(1.40±0.09)%>姜黄素治疗组(1.19±0.15)%>依那普利治疗组(0.87±0.12)%>模型组(0.56±0.07)%>正常对照组(0.30±0.09)%,五组间两两比较,P<0.05,差异具有统计学意义。5.2肝组织bax mRNA表达:模型组、依那普利治疗、姜黄素治疗组、联合治疗组、正常对照组bax mRNA表达水平明显下降:模型组(1.06±0.14)%>依那普利治疗组(0.92±0.07)%>姜黄素治疗组(0.79±0.08)%>联合治疗组(0.67±0.09)%>正常对照组(0.51±0.10)%,五组间两两比较,P <0.05,差异具有统计学意义。6肝组织纤维化程度与肝组织Bcl-2和Bax蛋白表达的相关关系:Bax与纤维化程度呈正相关,纤维化越重,Bax表达越多;Bcl-2/Bax的比值与纤维化程度呈负相关,纤维化越重,比值越小。结论:1应用10%CC14橄榄油溶液腹腔注射10周,可成功建立符合血清生化学和病理特征的小鼠肝纤维化模型。2肝细胞凋亡是肝纤维化发病的重要机制之一,核因子NF-κB与Bcl-2基因家族与肝细胞凋亡的关系最为密切。Bcl-2是最重要的抗凋亡因子,又被称为“生存基因”。Bax基因是Bcl-2的同源基因,是最重要的促凋亡因子,两者之间的比值决定细胞的生存或凋亡,Bcl-2/Bax比值增加,细胞凋亡减少,Bcl-2/Bax比值降低,细胞凋亡增加。Bax与纤维化程度呈正相关,Bcl-2/Bax的比值与纤维化程度呈负相关。3单用姜黄素及依那普利可以预防四氯化碳所致的小鼠肝纤维化的形成,姜黄素联合依那普利应用时,对预防四氯化碳所致的小鼠肝纤维化效果最好,机理是通过抑制NF-κB活性进而了抑制Bax的表达,促进Bcl-2的表达,抑制了肝细胞凋亡,而减轻肝了纤维化。