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鸡白痢（Pullorumdisease）是一种急性、全身性传染病,给养禽业带来了巨大的危害,其病原为鸡白痢沙门菌（Salmonella enterica serovar Pullorum,Salmonella Pullorum）,具有宿主专嗜性,可引起雏鸡的急性败血症;也可以感染成年鸡,常导致母鸡产蛋减少,体重下降,或导致孵化率和出雏率明显下降,该病原菌亦可垂直传播给子代。鸡白痢沙门菌作为兼性胞内寄生菌,在鸡体内诱导的免疫应答偏向于Th2型,有助于其在巨噬细胞内存活,为细菌持续感染提供了有利的条件,是鸡白痢免疫防控的难点。挖掘鸡白痢沙门菌中与Th2应答相关的抗原（诱导Th2应答或抑制Th1应答的抗原）,有助于鸡白痢沙门菌持续感染的机制的解析,同时为鸡白痢疫苗的研制提供新思路和新靶点。巨噬细胞M1/M2表型与T细胞介导Th1/Th2应答存在相互联系,M1巨噬细胞产生的IL-12、趋化因子CXCL9和CXCL10会促进Th1细胞的分化,Th1应答中的IFN-γ会刺激巨噬细胞产生M1极化;M2巨噬细胞产生的趋化因子CCL17、CCL22和CCL24则促进Th2细胞的分化,Th2应答中的IL-4会诱导巨噬细胞产生M2极化。因此,通过检测巨噬细胞的极化分型可以间接反映宿主的T细胞应答类型。巨噬细胞的极化分型中存在着不同的精氨酸代谢途径,其中诱导型一氧化氮合成酶（Induciblenitricoxidesynthase,iNOS）是M1巨噬细胞的重要标志物,可将精氨酸代谢为一氧化氮（Nitric oxide,NO）和鸟氨酸。因此巨噬细胞NO的产生可以作为其极化分型的指标。本研究通过构建鸡白痢沙门菌转座突变库,以巨噬细胞为感染模型,基于突变株感染后巨噬细胞中NO的产生判断巨噬细胞是否发生M1极化,从而筛选出促进Th1应答的候选突变株,相应的基因编码产物即为抑制Th1或诱导Th2应答的候选抗原。构建相关基因的缺失株,通过体外实验和体内实验评价缺失株诱导Th1/Th2免疫应答的能力以及机体免疫应答对相应病原菌的清除作用,并初步评价其作为疫苗候选株的潜能。进一步为鸡白痢沙门菌持续感染机制的解析以及鸡白痢防控技术的开发提供理论依据和靶点。1.鸡白痢沙门菌中调控巨噬细胞产生NO的基因筛选利用pSC189转座质粒构建鸡白痢沙门菌449/87的转座子突变库,PCR及抗性鉴定结果显示转座子插入到鸡白痢沙门菌基因组中的成功率为100%。以鸡巨噬细胞系HD11为感染模型,利用转座突变株感染细胞,通过检测NO的产生情况进行鸡白痢沙门菌影响宿主NO产生相关基因的高通量筛选。本文共筛选了2807个转座突变株,与野生株449/87感染组相比,诱导HD11产生NO上调的菌株有49个,下调的菌株有12个。通过PCR、测序和比对分析对筛选出来的转座突变株进行基因定位,并构建相应的基因缺失株和回复株,以构建的鸡白痢沙门菌基因缺失株、回复株和野生株感染HD11,对上述筛选结果进行验证,结果表明,与野生株449/87感染组相比,arcB、cyaA、cysB、hilA、glnD、invE和prgI的单基因缺失株可显著上调NO的产生。2.鸡白痢沙门菌中NO相关基因对巨噬细胞M1/M2极化分型的影响利用贴壁培养法制备鸡外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）来源的原代巨噬细胞,流式细胞术检测结果显示以7.5×106cells/孔接种6孔板时,获得的巨噬细胞纯度最高,为93%。野生株449/87和基因缺失株感染原代巨噬细胞后NO的检测结果显示,cysB、arcB、prgI、invE、hilA、cyaA和glnD7个基因的单基因缺失株均能显著上调巨噬细胞产生的NO,与HD11细胞感染模型的结果一致。将上述7个单基因缺失株感染HD11和原代巨噬细胞后,检测iNOS的活性,IFN-γ、IL-12p40、IL-4和IL-10 mRNA水平及IL-12p40蛋白质水平。结果显示,与野生株449/87相比,7个单基因缺失株感染后HD11和原代巨噬细胞中iNOS活性显著增加,IL-12p40蛋白水平也显著提高,表明缺失株感染巨噬细胞后会促进其M1极化。与野生株449/87感染组相比,7个单基因缺失株感染HD11后Th2相关细胞因子IL-4和IL-10 mRNA水平没有变化,而Th1相关细胞因子IL-12p40 mRNA显著上调;另外,除了449/87ΔcysB和449/87ΔglnD,其余5个基因（prgI、invE、hilA、cyaA和arcB）的单基因缺失株均可以显著上调HD11感染后的IFN-γ mRNA水平,表明这5个缺失株可能通过上调HD11产生的IFN-γ促进其M1极化。在鸡原代巨噬细胞感染模型中,相比野生株449/87,cyaA、hilA和invE单基因缺失株感染后Th1相关细胞因子IFN-γ mRNA显著上调,而Th2相关细胞因子IL-4mRNA显著下调,表明449/87ΔcyaA、449/87ΔhilA和449/87Δ invE通过上调原代巨噬细胞产生的IFN-γ从而促进其发生M1极化,且同时通过下调IL-4从而抑制其发生M2极化。3.鸡白痢沙门菌449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA诱导鸡体免疫应答的研究将鸡白痢沙门菌449/87、449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA分别通过肌肉注射方式接种海兰白雏鸡,在感染后不同时间点分别收集肝脏和脾脏,观察脏器的组织病理学变化。通过检测血清抗体、脾脏CD4+/CD8+T细胞的比例、淋巴细胞增殖和细胞因子表达水平,评估了 449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA感染雏鸡后激发的体液和细胞免疫应答。血清抗体检测结果显示,449/87和449/87ΔhilA感染雏鸡后可诱导机体产生相同水平的鸡白痢沙门菌抗体,而449/87ΔcyaA感染组的抗体低于449/87野生株感染组,表明CyaA的缺失降低了鸡白痢沙门菌激发的体液免疫应答水平。脾脏CD4+和CD8+T细胞的比例及脾脏淋巴细胞增殖试验检测结果显示,与449/87野生株感染组相比,449/87ΔcyaA感染的鸡脾脏CD4+T细胞减少,CD8+T细胞增加（21 d）,449/87ΔhilA感染组脾脏CD4+T细胞比例增加（28 d）;449/87ΔcyaA和449/87ΔhilA感染的鸡分别在感染后21和28 d时其脾脏细胞增殖能力显著增强,表明这两个基因缺失株诱导T淋巴细胞应答的能力增强。脾脏细胞因子检测结果显示,与449/87野生株感染组相比,449/87ΔhilA感染组IFN-γ mRNA水平显著升高（感染后的3和7 d）;449/87ΔcyaA感染组IFN-γ mRNA表达水平升高（感染后7d）,IL-4 mRNA水平显著降低（感染后的3 d）。以上结果表明,449/87AcyaA和449/87ΔhilA感染后海兰白鸡产生的应答均偏向Th1型。对449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA感染组肝脏和脾脏中的载菌量进行检测,发现449/87ΔcyaA感染组肝脏和脾脏中定植的菌量较少,且分别在感染后7d和21d,肝脏和脾脏中的449/87ΔcyaA被清除。449/87ΔhilA感染组肝脏和脾脏中沙门菌的定植量低于野生株组,且在感染后第21d,肝脏中的449/8 7ΔhilA被清除。以上结果表明缺失株诱导的Th1应答可加速机体对细菌的清除。4.鸡白痢沙门菌449/87ΔcyaA作为疫苗候选株的免疫保护效力评估以3日龄海兰白雏鸡为模型进行449/87和449/87ΔcyaA的LD50测定,结果显示肌肉注射时449/87和449/87ΔcyaA的 LD50分别为7.02×107 CFU和4.82×109 CFU,表明CyaA缺失后鸡白痢沙门菌的毒力减弱。将449/87△cyaA以1×107CFU/只的剂量通过肌肉注射免疫接种3日龄海兰白雏鸡进行疫苗免疫保护效力的评估。体重变化和临床表现显示,与PBS对照组相比,449/87ΔcyaA免疫组的鸡只生长性能正常,且未出现任何临床症状。血清抗体水平检测结果显示449/87ΔcyaA免疫后第14和21d鸡体产生针对鸡白痢沙门菌的抗体。脾脏淋巴细胞增殖试验结果显示,449/87ΔcyaA免疫组的脾脏细胞在ConA和可溶性抗原刺激下增殖能力显著提高。细胞毒性淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）结果显示,449/87ΔcyaA免疫组的脾脏CD8+T细胞对靶细胞（449/87感染的巨噬细胞）具有较强的杀伤能力,显著高于未免疫组。免疫后第14d对雏鸡进行攻毒,攻毒后免疫组鸡只没有明显临床症状,鸡只的存活率为100%;而未免疫攻毒组的鸡却呈现高发病率和死亡率。细菌定植结果显示,在攻毒后的第3和14d,免疫后攻毒组肝脏中的鸡白痢沙门菌载量显著低于未免疫攻毒组。上述结果表明鸡白痢沙门菌减毒株449/87ΔcyaA可诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,为雏鸡提供良好的保护效力,具有作为鸡白痢疫苗候选株的潜力。