“基因编辑”和“肿瘤治疗”作为当今生命科学领域的两大研究热点,都存在着一些亟待解决的科学问题:在基因编辑领域,CRISPR-Cas9基因编辑技术由于Cas9表达的不可控性导致的脱靶效应会产生严重、不可预估的副作用,因而被极大地限制了其临床应用。在肿瘤治疗领域,手术切除、化疗、放疗作为当前肿瘤治疗最为推荐的方式,却由于治愈率低、副作用大而倍受诟病;而新兴的肿瘤免疫疗法虽然能产生良好的治疗效果,却由于其不可控性导致的免疫系统过度激活问题而无法大规模应用于临床。总之,这两大研究热点领域都亟需精准控制技术来解决不可控性而导致的安全问题。因此,开发精准可控的基因编辑技术和新型肿瘤免疫治疗手段对于解决上述安全问题具有重大意义。光遗传学技术将光学技术和遗传学技术相结合,能够精确控制细胞的行为。该技术以其独有的非侵入性、时空特异性精准控制的优势而被广泛应用于生物医学领域。针对上述科学问题,将合成生物学思想与光遗传学技术相结合,并利用本课题组前期研发的远红光调控基因表达控制系统（FRL-v2）,我们分别以“远红光调控split-Cas9基因编辑系统的构建及其应用研究”和“远红光调控的新型肿瘤免疫疗法用于防止肿瘤手术切除后复发的研究”为主题,开展了可控基因编辑和可控肿瘤治疗两个方向的应用研究。1.远红光调控split-Cas9基因编辑系统的构建及其应用研究（1）设计、构建并优化获得了远红光调控split-Cas9基因编辑系统（FAST）。实验结果表明:FAST系统可以在多种人类细胞的多个基因位点实现NHEJ和HDR两种方式介导的光控基因编辑。（2）深度研究了FAST系统介导的基因编辑动力学特征等性能。实验结果显示:FAST系统呈现出光照强度和光照时间依赖性的可时空特异性精确调控的基因编辑,且几乎无细胞毒性。通过T7E1方法对人基因组中BMP1基因易脱靶位点的检测,我们发现与全长Cas9相比,FAST系统可以显著降低脱靶效应。（3）在三种不同小鼠模型中,研究了FAST系统在体内可控基因编辑的能力。在皮下移植模型小鼠中初步验证了FAST系统在体内基因编辑的优势;td Tomato转基因报告模型小鼠中验证了FAST系统能以低强度的远红光LED照射方式对小鼠内脏器官中的成体细胞进行基因编辑;在人肺癌细胞异种移植肿瘤模型小鼠体内验证了FAST系统可以对瘤内致癌基因PLK1进行敲除而显著抑制肿瘤的生长。2.远红光调控新型肿瘤免疫疗法用于防止肿瘤术后复发的研究（1）设计、构建获得远红光调控的免疫调节基因环路,并筛选了工程化稳转细胞株。获得了远红光调控表达分泌IFN-β,TNF-α和IL-12三种细胞因子的免疫调节工程化细胞（命名为IREC）,光照诱导表达倍数高达200多倍。（2）测试远红光调控的免疫调节工程化细胞长期性分泌细胞因子的能力及体外动力学特征。该工程化细胞制成的移植载体（水凝胶）在体外培养环境中能够可控分泌细胞因子长达一个月,且具有光照强度、光照时间依赖性和可逆性。（3）研究远红光调控新型肿瘤免疫疗法在黑色素瘤模型小鼠体内的抗肿瘤效果。通过对小鼠肿瘤体积、生存率的监测,发现该疗法具有显著的抗肿瘤效果,治疗后60天内小鼠生存率达到100%。（4）探究该疗法产生抗肿瘤效果的内部作用机制。通过检测血清中IFN-β,TNF-α,IL-12,CXCL10,IFN-α和IFN-γ六种抗肿瘤细胞因子含量变化,发现光照组小鼠体内细胞因子的含量显著升高。通过流式细胞术对外周血和脾脏中NK细胞和T细胞进行检测,发现光照组小鼠的NK细胞和T细胞占比上升,两者的活化细胞比例也显著提升。（5）安全性评估。通过血常规以及血液生化指标检测,发现治疗组小鼠与未治疗组小鼠无显著差异,由此证明该疗法安全可靠。综上所述,本论文的主要研究内容是利用光控基因表达系统开发可控的CRISPR-Cas9基因编辑系统和新型的光控肿瘤免疫疗法。首先,远红光调控split-Cas9基因编辑系统,有望解决CRISRP-Cas9技术不可控性而导致的脱靶效应,同时可实现时空特异性精准基因编辑。这项研究提供了一种适合于体内应用的新型可控的基因编辑工具,进一步扩展了CRISPR-Cas9基因编辑工具箱,有望用于基因功能的研究,以及遗传病、肿瘤等多种疾病的精准可控治疗。其次,通过开发一种远红光调控的免疫调节工程化细胞实现肿瘤手术切除疗法与肿瘤局部免疫疗法联合的新型肿瘤免疫治疗,解决肿瘤手术切除后易复发转移的问题,提高肿瘤切除治愈率,同时又能避免肿瘤免疫疗法由于不可控性导致的免疫系统过度激活问题。该项研究为肿瘤手术切除疗法的治愈率提供了保障,为细胞因子免疫疗法,局部免疫疗法提供了新思路,扩展了肿瘤免疫治疗手段。本论文的研究成果为光遗传学在生物医学领域的应用做出了新探索并提供了新方向。