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D-丙氨酸是一种重要的非天然手性α-氨基酸,它是一种重要的化工原料和医药中间体,广泛应用于手性药物、手性添加剂、手性助剂等领域。本课题旨在研究利用微生物酯酶拆分N-叔丁基氧羰基(BOC)-DL-丙氨酸甲酯以制备N-BOC-D-丙氨酸甲酯。采用N-BOC-DL-丙氨酸甲酯为唯一碳源的富集培养法,从土壤中筛选到一株立体选择性较高的L-构型水解酶产生菌,通过形态学观察和16SrDNA序列分析,确定为解淀粉芽孢杆菌,并命名为Bacillus amyloliquefaciens WZZ002(CCTCC M 2013366)。通过单因素实验对B.amyloliquefaciens WZZ002的发酵产酶条件进行研究,确定其最优发酵培养基配方为:可溶性淀粉0.6%,蛋白胨1.6%,酵母膏0.1%,MgSO4 1 mmol/L;最佳培养条件为:初始pH 7.0,温度30℃,发酵培养24 h。在此条件下发酵培养所得菌体催化底物N-BOC-DL-丙氨酸甲酯水解的e.e.s值从23.8%提高到49.2%,转化率从19.4%提高到33.1%,生物量从0.86 g/L提高到2.21 g/L,对映体选择率E大于300。实验对B.amyloliquefaciens WZZ002全细胞水解拆分N-BOC-DL-丙氨酸甲酯的反应条件进行研究,确定最优反应条件为:全细胞催化剂添加量50g/L,底物浓度2M,反应温度35℃,NH3·H2O为中和剂,反应过程中pH维持为8.0。在最优反应条件下反应10 h,e.e.s值达到99.9%以上,e.e.p值大于98%,转化率为50.1%。实验研究了以海藻酸钠包埋法对B.amyloliquefaciensWZZ002进行细胞固定化,并考察其固定化条件,得到最优的细胞固定化条件为:海藻酸钠浓度为2%,CaCl2浓度为4%,4℃下钙化4h。以固定化细胞为催化剂,重复水解反应10批次,酶活力仍能保留85%以上,证明了该固定化细胞具有良好的可重复利用性和稳定性。为了获得B.amyloliquefaciens WZZ002所产能立体选择性水解N-BOC-DZ-丙氨酸甲酯的目的酯酶,通过发酵液的硫酸铵分级沉淀、DEAE离子交换层析和苯基疏水性层析,得到了电泳纯的目的酯酶,其蛋白分子量约为50 kDa。通过酶的分离纯化,比酶活力由9.27 U/mg提高到142.92 U/mg,回收率9.57%,纯化倍数15.42。并对该酯酶的酶学性质进行了研究,结果显示其最适pH为8.0,最适温度55 ℃,Fe2+、K+对该酶有促进作用,A13+、EDTA对该酶有抑制作用,吐温20和吐温80对该酶有促进作用。此外还研究了B.amyloliquefaciens WZZ002酯酶的底物特异性,发现该酯酶倾向于水解短链长的三酰甘油酯,因此可以预测B.amyloliquefaciens WZZ002所产对N-BOC-DL-丙氨酸甲酯有立体选择性水解作用的酶为酯酶。