牛气管抗菌肽(bTAP)是牛气管黏膜上皮细胞分泌的具有广谱抗菌活性的多肽。与抗生素的作用机制不同,抗菌肽为动物体天然的防御因子,不易产生耐药菌株,是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物,但天然抗菌肽的产量极低。毕赤酵母(Pichia Pastoris)不仅具有真核表达系统的蛋白翻译后加工修饰等优点,而且基因操作相对简单,表达水平较高。本研究根据已发表的bTAP基因序列和酵母细胞的密码子偏爱性设计两对引物,以重叠延伸PCR扩增出bTAP成熟肽编码序列,然后将其构建到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,用限制性内切酶SalⅠ或BglⅡ酶切线性化后转化毕赤酵母GS115株感受态细胞,在组氨酸缺乏的培养基上筛选得转化酵母菌,然后在含不同浓度G418的YPD平板上培养,筛选得抗3mg/ml G418的Mut+型重组酵母菌3株,抗1mg/ml G418的Muts型酵母菌1株。在此基础上,以初次转化的重组酵母菌制备感受态细胞,用同样线性化的重组质粒进行二次电转化,并选获得了表达水平较高的重组酵母菌。最后将获得的高拷贝酵母转化菌在BMGY培养液中培养,用含甲醇的BMMY培养液诱导表达,SDS-PAGE结果显示,与空表达载体转化酵母菌的诱导上清相比,重组酵母菌诱导培养上清中表达有一条特异蛋白条带,大小为4kDa左右。平板法抑菌实验证明对大肠杆菌、微球菌生长具有明显的抑制作用。