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目的:1.验证MMP14、Survivin及Kras在胰腺癌高表达,且与胰腺炎及正常胰腺组织表达情况进行比较,差异有统计学意义。2.构建MMP14基因序列及质粒载体p ET-30a-m MMP14,将其导入大肠杆菌中构成原核表达体系,通过IPTG诱导表达并纯化出MMP14蛋白。方法:1.收集43例胰腺癌、13例胰腺炎及21例正常胰腺组织标本进行免疫组织化学染色,分析MMP14、Survivin及Kras蛋白在三种组织内表达的程度、差异及与胰腺癌患者临床病理参数间的关系。2.合成并优化MMP14基因序列,构建原核质粒载体p ET-30a-m MMP14,对其进行双酶切鉴定,确定该质粒载体构建成功。再将p ET-30a-m MMP14转化至Rosetta(DE3)细胞中,以不同浓度IPTG进行诱导表达,摸索适宜条件,对表达产物进行镍柱层析纯化。结果:1.显示MMP14、Survivin及Kras蛋白在胰腺癌组织中高表达,与非癌组织比较,差异有统计学意义。2.MMP14及Survivin蛋白的表达情况与胰腺癌患者临床病理参数无关,Kras蛋白的表达与年龄呈正相关,年龄越大的胰腺癌患者越容易出现Kras蛋白的高表达。3.MMP14、Survivin及Kras蛋白在胰腺炎及正常胰腺组织内表达差异无统计学意义。4.通过对截短后的MMP14基因序列进行稀有密码子优化,得到了m MMP14序列,将其与原始MMP14序列进行基因比对,发现相符率约为74%,达到实验要求,遂即全基因合成原核表达载体p ET-30a-m MMP14。5.将p ET-30a-m MMP14转化至Rosetta(DE3)细胞后,在0.4 mm IPTG浓度,37℃条件下诱导4 h后可获得高度表达的MMP14蛋白,最终经过多次镍柱层析纯化得到了纯度在80%以上的MMP14蛋白。结论:1.MMP14、Survivin及Kras蛋白在胰腺癌明显高表达,可以作为胰腺癌分子诊断的靶点。2.成功构建了原核质粒载体p ET-30a-m MMP14,将该载体转化入感受态细胞Rosetta(DE3)后,可以正常表达MMP14蛋白,再经镍柱层析纯化,最终得到了纯度在80%以上的MMP14蛋白,可以用于后续的细胞SELEX筛选实验。