研究背景冠状动脉血管成形术后发生再狭窄是冠脉介入治疗失败的重要原因。动脉支架植入技术投入临床使用后,再狭窄发病率明显降低,显著减少了介入术后血管弹性收缩和血管重塑,但无法完全抑制新生内膜增生。在正常血管的中膜中,平滑肌细胞以极低速率增殖且大部分都处于细胞周期的G0期,为"静止"状态。而血管损伤会刺激平滑肌细胞活化,进入细胞周期的增殖阶段,并增加细胞迁移。为了抑制这种现象,以抑制平滑肌增殖为主要靶点的几种药物如雷帕霉素等,现在临床广泛用于制作药物洗脱支架,虽然药物支架不能完全避免新生内膜增生,但已被证明可以降低再狭窄的发生率。然而近来有研究表明,使用药物洗脱支架进行经皮冠状动脉介入治疗的患者和使用裸金属支架的患者相比,出现了"晚期追赶"现象,即六年死亡率、生活质量、不稳定性心绞痛入院等方面无显著差异。为了应对这一挑战,需要寻求新的靶点以及更好的治疗方法来防治再狭窄的发生。损伤血管新生内膜增生时,平滑肌细胞大量增殖。而细胞增殖需要合成大量蛋白质。核糖体是蛋白质合成的工厂。在细胞核仁中,RNA聚合酶Ⅰ转录核糖体DNA成为核糖体RNA前体,经过多个步骤的剪切,生成成熟的18S,5.8S和28S核糖体RNA,进而与核糖体蛋白结合形成核糖体大小亚基。在某些肿瘤细胞中,RNA聚合酶Ⅰ过度活化,而抑制核糖体RNA合成能够降低细胞的增殖能力。CX-5461是一种新型的RNA聚合酶Ⅰ的特异性抑制剂,研究证实CX-5461对于快速增殖状态下的细胞有明显的抑制作用,该化合物目前正在进行白血病和实体肿瘤治疗的早期临床实验。干预RNA聚合酶Ⅰ对心血管细胞的作用目前尚没有任何报道。有证据表明,血管平滑肌细胞的增殖可能和蛋白质合成速率增加有关。因此,在以下的研究中,我们检测了特异性RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX-5461在血管平滑肌细胞中的药理作用,探讨了 CX-5461在抑制平滑肌异常增殖及动脉再狭窄过程中的可能机制。研究目的1.研究CX-5461对于大鼠颈动脉球囊拉伤模型后内膜增生的影响。2.研究CX-5461改善血管损伤后新生内膜增生的生物学机制。研究方法1.实验动物分组实验动物购自北京维通利华公司,选取250-300g雄性Wistar大鼠。所有动物实验均符合山东大学齐鲁医院伦理委员会对于动物实验的规定和要求。大鼠被随机分为4组:假手术组(Sham)、球囊拉伤组、球囊拉伤+CX-5461低剂量(0.7μM)组、球囊拉伤+CX-5461高剂量(14uM)组。2.建立动物模型大鼠根据体重进行麻醉,腹腔注射0.8%戊巴比妥钠(60mg/kg)。备皮后取颈部正中切口,暴露颈总动脉和颈内外动脉。阻断颈总动脉血流,在颈外动脉近心端用缝合线打一活结,随后在颈外动脉活结远心端做一切口,使用1.25*10mm球囊从切口处进入颈总动脉约2cm,给予3atm压力使球囊扩张,向远心端回撤球囊至切口处,释放球囊压力,再次送入颈总动脉,三次操作后撤出球囊,结扎颈外动脉切口近心端。逐层缝合组织。将CX-5461以不同浓度(溶于5%DMSO溶液)溶于25%的Pluronic F127溶液中,在拉伤部位滴加200μL。球囊拉伤组滴加含有5%DMSO的Pluronic F127溶液。假手术组只暴露血管,滴加5%DMSO-Pluronic F127溶液,不进行球囊拉伤。逐层缝合组织。术后给予美洛昔康(1mg/kg)镇痛处理。3.组织取材、制作切片实验大鼠术后14天进行取材。麻醉后暴露颈总动脉,取拉伤部位大鼠颈总动脉组织4%多聚甲醛固定过夜,脱水后进行石蜡包埋,制作4 μm血管横切片;剩余大鼠血管组织液氮保存。4.组织病理学检测组织切片脱蜡、复水,进行Verhoeff-VanGieson染色(弹力板呈棕色,使新生内膜更加明显),苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin)染色。中性树脂封片、干燥,显微镜下观察并保存图像。5.伊文氏蓝检测大鼠安乐死前30分钟,经尾静脉注射0.5毫升0.5%伊万斯蓝染料。按照上述步骤取出球囊损伤的颈动脉段,将血管固定在100%甲醇并纵向切开。镜下观察并采集图像。6.组织化学检测组织切片经过脱蜡、复水、3%H202灭活内源性过氧化物酶、抗原修复、封闭,4摄氏度孵育不同目的蛋白的一抗过夜,次日37摄氏度孵育二抗2小时,滴加DAB显色液,同一目的蛋白使用同一时间显色。用苏木素将细胞核染色,中性树脂封片、干燥。显微镜下观察并采集图像。7.组织免疫荧光检测组织切片经过脱蜡、复水、3%H202灭活内源性过氧化物酶、抗原修复、5%BSA封闭,4摄氏度孵育不同目的蛋白的一抗过夜,次日37摄氏度孵育免疫荧光二抗,DAPI染核,抗荧光淬灭剂封片。8.组织蛋白质免疫印迹用研磨器裂解颈总动脉组织并在冰上提取蛋白,SDS-PAGE电泳恒压分离蛋白样品,将蛋白湿式转膜至硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶粉封闭,4° C摇床孵不同目的蛋白特异性一抗过夜,次日TBST洗膜3次,室温孵育二抗2小时。ECL发光液使目的蛋白条带显影,并用LAS-4000化学发光仪检测。9.组织实时定量PCR检测实验大鼠术后14天取材,液氮保存。将冻存的组织加入Trizol,用研磨器研磨,随后依次分别加入氯仿、异丙醇、无水乙醇逐次离心使RNA析出,提取RNA并测量浓度。根据Takara PrimeScriptrM RT reagent Kit逆转录试剂盒进行RNA逆转录。随后根据SYBR(?)Select Master Mix试剂盒提供的方法进行Real-time PCR,以GAPDH或β-actin作为管家基因,检测目的基因表达量,用相对定量的方法进行数据分析。10.血管平滑肌细胞的培养小鼠血管平滑肌细胞系MOVAS购自ATCC公司。细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养,在细胞培养箱中以37摄氏度,5%C02环境下培养细胞。当密度达80%左右时将细胞传代。11.细胞活力测定采用MTT法测定细胞活性。将细胞接种于96孔板中,给予不同刺激后根据CelllTiter 96 Aqueous kit(Promega)试剂盒,选取490nm波长用酶标仪进行检测。12.数据测量及统计数据均采用均数±标准差表示。数据分析使用非配对t检验或方差分析以及Newman-Keuls两两检验分析数据。认为P<0.05有统计学意义。研究结果1.CX-5461的药理学特征由于之前没有CX-5461对于心血管系统作用的相关研究,我们先检测CX-5461对于MOVAS的药理学特征。使用MTT法检测CX-5461对细胞的增殖的抑制作用,得出其EC50= 1.06μM。2.CX-5461对血管损伤诱导的新生内膜增生的影响根据CX-5461对细胞的抑制作用的检测,我们选取高于和低于EC50的浓度(14μM和0.7 μM)来检测药物对球囊拉伤后血管新生内膜形成的抑制作用。通过不同组大鼠组织的HE染色和Verhoeff染色对比:术后14天,0.7 μM和14 μM CX-5461组大鼠颈总动脉内膜面积、内膜/中膜面积比(I/M)均低于球囊拉伤组,且呈剂量依赖关系。而CX-5461对于正常血管中膜细胞的大体形态、分布,没有明显影响。3.CX-5461对血管壁细胞增殖周期的影响我们对血管组织进行PCNA、cyclin A和Aurora B免疫组化或免疫荧光染色。Aurora B是有丝分裂期的标志。假手术组、拉伤组血管中膜均未发现Aurora B阳性细胞。研究证实,位于核仁中的cyclinA发挥调节细胞周期的作用,而cyclin A在S-G2期表达量较高。因此我们统计了在核仁中高表达cyclin A的细胞比例,结果显示:球囊拉伤组血管中膜高表达cyclin-A的细胞数量有所下降,原因可能是活化的平滑肌细胞迁移至内膜;而CX-5461组血管中膜中高表达cyclin-A的细胞较假手术组明显升高。PCNA经常作为细胞增殖旺盛的标志,其在细胞周期中G1开始合成,S期表达水平最高。假手术组、拉伤组和给药组中膜中PCNA-高表达的细胞并无显著性差异。综合分析以上结果,提示CX-5461能够引起血管中膜平滑肌细胞G2/M期细胞周期阻滞。4.CX-5461对血管内皮细胞的影响血管伊文氏蓝染色结果显示:低剂量的CX-5461对血管内皮的恢复过程无明显影响,而高剂量CX-5461使血管再内皮化率降低约35%。5.球囊损伤后血管组织核糖体RNA合成增加上游结合因子-1(phosphorylation of upstream binding factor-1,UBF-1)是rDNA转录所必须的核转录因子。我们用免疫组化方法对血管组织中的UBF-1磷酸化水平进行了检测。结果显示损伤组血管新生内膜部分和中膜部分UBF-1磷酸化水平均明显升高,提示血管损伤后新生内膜形成过程中rRNA合成增强。6.CX-5461增加p53磷酸化、乙酰化水平研究显示p53的翻译后修饰,包括磷酸化和乙酰化,可以增强p53的转录因子功能。免疫组织化学染色结果显示:血管中膜中p53的磷酸化水平和p53的乙酰化水平较假手术组和损伤组均有所升高,同时,新生内膜中这些指标也升高明显。与此相一致,qPCR结果显示CX-5461处理后p53的靶基因p21CIP/WAFI和GADD45的表达水平显著增加。组织westernblot结果显示:和假手术组相比,CX-5461高剂量组(无新生内膜)血管组织的p53磷酸化和乙酰化水平都有所升高,而球囊损伤组血管组织的p53磷酸化和乙酰化水平也升高明显,其原因可能是组织包含的新生内膜中p53翻译后修饰水平较高。7.CX-5461引起ATM/ATR通路的激活研究显示,p53的磷酸化和G2/M过渡期都受ATM(共济失调毛细血管扩张症突变基因the ataxia telangiectasia mutated)/ATR(共济失调毛细血管扩张症与Rad3相关ataxia telangiectasia and Rad3-related)通路的调节。我们通过检测ATM/ATR底物结构域S/T*Q的磷酸化水平对ATM/ATR通路的活性进行观察,发现CX-5461处理后ATM/ATR通路的活性显著增加。结论1.CX-5461显著抑制动脉损伤造成的新生内膜增生。2.CX-5461可能引起损伤血管中膜细胞发生G2/M周期阻滞。3.CX-5461抑制细胞增殖可能通过激活ATM/ATR通路发挥作用。研究背景我们之前的研究表明,RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX-5461在大鼠颈动脉球囊损伤模型中,可以抑制受损血管新生内膜形成,并且ATM/ATR通路的激活和p53翻译后修饰水平升高可能参与介导抑制作用。但其细胞水平的作用和机制尚未阐明。CX-5461是一种新型RNA聚合酶Ⅰ特异性抑制剂,能够抑制某些肿瘤细胞中RNA聚合酶Ⅰ的过度活化,抑制其快速增殖。在本研究中,我们探究CX-5461对快速增殖的血管平滑肌细胞的药理作用及主要机制。近年来,以细胞周期及其调控因子作为再狭窄治疗的作用靶点的研究越来越多。细胞周期包括两个时期:间期(两个有丝分裂期之间的时期);分裂期(细胞分裂的过程)。间期分为四个时期:G0,G1,S和G2。G1期中,细胞为DNA复制做准备,在G1后期存在检查点R。之后,细胞在S期进行DNA复制,在G2期合成有丝分裂所需要的大量蛋白质。同时,G2期也有一个检查点来检测合成DNA的质量。细胞周期调控对于血管平滑肌细胞增殖至关重要,因此我们在此部分探索CX-5461是否对细胞周期产生影响。核仁是核糖体生物合成的场所,破坏核仁的正常功能会产生一种独特的细胞应激反应,称为核仁应激,造成p53蛋白水平升高。CX-5461是核糖体DNA转录所必须的RNA聚合酶Ⅰ的特异性抑制剂。在此部分研究中,我们将探索PolⅠ抑制在血管平滑肌细胞中是否引起核仁应激反应。ATM(共济失调-毛细血管扩张突变基因ataxia telangiectasia-mutated)/ATR(共济失调毛细血管扩张症和Rad-3相关蛋白,ataxia telangiectasia-mutated and Rad-3 related factor)激酶系统是DNA损伤时激活的经典通路。ATM、ATR都属于PI-3K家族,功能既有重复也不完全相同。UV、缺氧等条件都能激活ATM/ATR通路并活化下游靶蛋白(如p53蛋白等),阻滞细胞周期,从而对受损DNA进行修复。我们在此探讨CX-5461对血管平滑肌细胞中ATM/ATR通路的作用。研究证实,现在临床广泛应用的雷帕霉素药物洗脱支架会延缓术后再内皮化的过程,可能导致术后血栓形成,是影响介入手术结果的重要因素。在本研究中,我们也初步探讨CX-5461对于血管内皮细胞的影响。研究目的:1.研究CX-5461在细胞水平对血管平滑肌细胞增殖的影响。2.探索CX-5461抑制血管平滑肌细胞快速增殖的可能机制。3.初步研究CX-5461对血管内皮细胞的影响。研究方法1.细胞培养1.1.小鼠血管平滑肌细胞系MOVAS的培养细胞来源、培养方法同论文Ⅱ。1.2.人脐静脉内皮细胞的培养人脐静脉内皮细胞系(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)购自ATCC公司。细胞培养于含有5%胎牛血清、内皮细胞生长因子(1OOU/ml)以及青链霉素(100 μg/ml)的完全内皮细胞培养基(ECM)。细胞培养箱温度稳定37° C,CO2浓度为5%。细胞密度达到70-80%时传代,选择第3-6代细胞进行实验。1.3.原代大鼠胸主动脉平滑肌细胞提取及培养取150-250gWistar雄性大鼠一只,腹腔注射0.8%戊巴比妥钠(60mg/kg)进行麻醉,在无菌条件下迅速暴露胸主动脉并将其取出,置入D-Hanks液无菌培养皿中。清洗血管中的血块并剥去外膜,纵向剪开血管,用镊子刮去内膜。将血管尽量剪碎并离心,接种于含有20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中,在37° C、5%CO2的细胞培养箱中静置培养,3-5天换液。细胞密度大时可呈峰-谷样表现。2.TUNEL检测细胞凋亡将MOVAS接种于八孔腔室载玻片,次日给予梯度浓度的CX-5461处理,以猩孢霉素(100nM)处理组为阳性对照组。根据ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit(Merck Millipore)试剂盒检测 MOVAS凋亡情况。中性树脂封片、干燥,显微镜下,每孔随机选取5-10个视野计数阳性细胞和总细胞数观察并保存影像。3.细胞Caspase 3/7活性检测将MOVAS接种于96孔板中,次日给予梯度浓度的CX-5461处理,并设立猩孢霉素组为阳性对照组,5%DMSO组为阴性对照组。用预先配好的Caspase-Glo 3/7工作液孵育细胞1小时,随后将样品移入不透光的96孔板中,用荧光酶标仪检进行检测。4.细胞活力测定同论文Ⅱ。5.流式细胞术检测细胞周期将细胞接种于6孔板,药物处理后,将细胞用胰酶消化、离心,PBS洗涤后,以75%乙醇重悬细胞,置于-20° C冰箱固定过夜。次日用PBS洗涤细胞2次,离心沉淀后使用碘化丙啶染色,用流式细胞仪检测细胞周期。6.细胞蛋白免疫印迹在冰上用RIPA裂解液裂解细胞并提取蛋白,SDS-PAGE电泳恒压分离蛋白样品,将蛋白用湿式转膜法转至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭并孵育不同目的蛋白的特异性一抗,在4摄氏度摇床上过夜,次日用TBST洗膜3次,室温孵育二抗2小时后检测蛋白条带显影。7.细胞免疫荧光检测目的蛋白将细胞接种于八孔腔室载玻片,药物处理结束后以4%多聚甲醛固定,5%BSA封闭,随后加入特异性一抗4° C孵育过夜,次日孵育免疫荧光二抗,用DAPI染液染细胞核,抗荧光淬灭剂封片。8.GADD45 shRNA 病毒侵染将MOVAS接种于96孔板中,次日用含有5 μ g/ml Polybrene的DMEM培养基稀释病毒,并替换原培养基。24小时后换液。48小时后于荧光显微镜下观察荧光,检测病毒侵染效率。9.Transwell迁移试验采用Boyden小室法进行迁移实验。消化、离心后,重悬HUVEC于无血清的ECM培养基中,进行细胞计数。根据计数结果调整细胞数,使每孔细胞数目达到一致。于上室中加入细胞悬液,下室培养基中加入1%胎牛血清作为趋化因子,上下室培养基同时含有CX-5461或5%DMSO。于细胞培养箱中培养6小时后固定小室底部的细胞并用结晶紫染色。显微镜下观察,每个小室取5-10个视野计数并采集图像。10.划痕试验将细胞接种于6孔板,待密度达100%时用枪头沿直尺垂直于6孔板底部在细胞上迅速划过。细胞分别给予CX-5461或5%DMSO处理,于1、3、6、9、12、24小时采集图像,观察细胞迁移情况。提前做好标记,记录同一位置细胞迁移情况。11.数据测量及统计数据均采用均数±标准差表示。数据分析使用非配对t检验或方差分析以及Newman-Keuls两两检验分析数据。认为P<0.05有统计学意义。实验结果1.CX-5461对MOVAS增殖的影响根据CX-5461的EC50,用不同浓度的CX-5461处理细胞,通过MTT法检测药物对MOVAS增殖情况的影响。实验结果显示:0.07 μ M,0.7 μ M,2 μM,14 u M的CX-5461均能抑制MOVAS增殖,且抑制作用呈剂量依赖趋势。2.CX-5461对MOV AS凋亡的影响通过Caspase 3/7活性检测法和TUNEL法检测CX-5461处理MOVAS的凋亡情况。结果显示:CX-5461 0.07 μM、0.7 μM、2 μM、14 μM处理组和对照组相比,MOVAS凋亡情况无明显差异。因此,我们推测,CX-5461对MOVAS增殖的抑制作用并不依赖于细胞凋亡。3.CX-5461对血管平滑肌细胞Aurora B表达的影响通过免疫荧光检测我们发现,CX-5461处理降低血管平滑肌细胞中Aurora B的水平。提示CX-5461处理能够减少处于分裂期的血管平滑肌细胞的比例。4.CX-5461对血管平滑肌细胞细胞周期的影响通过流式细胞术检测细胞周期,结果显示:用CX-5461处理MOVAS,处于G2/M期细胞的比例较对照组明显增加,提示CX-5461处理MOVAS导致细胞G2/M期阻滞。鉴于MOVAS是经过改造的血管平滑肌细胞系,为了更好的模拟体内情况,我们选择大鼠胸主动脉原代平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)进行实验,并设置PDGF-BB处理(20ng/ml)组,使VSMC快速增殖。实验结果显示:在未经PDGF-BB处理的VSMC中,与对照组相比,CX-5461对细胞周期的作用不明显;而在PDGF-BB处理的VSMC中,CX-5461组细胞与对照组相比,处于G2/M期的细胞比例明显升高。细胞免疫荧光染色显示:用CX-5461处理VSMC,高表达PCNA细胞的比例和对照组相比无明显差异;而CX-5461处理组中,cyclin A定位于核仁中的细胞比例明显高于对照组。综合分析以上结果,提示CX-5461处理导致血管平滑肌细胞G2/M周期阻滞。5.CX-5461增加p53磷酸化水平但不能稳定p53我们通过测定核仁定位标记物NPM/B23(Nucleophosmin)的状态来检测CX-5461抑制Pol I是否会引起核仁应激。NPM免疫荧光显示:0.7 μ M CX-5641处理并不引起MOVAS中NPM分布的明显改变,而14μM处理组细胞NPM碎裂并弥散分布于核质,细胞发生明显的核仁应激。通过westernblot和免疫荧光检测MOVAS和VSMC的p53水平,均未发现p53水平升高,因此我们推测CX-5461的作用并不能完全用传统的核仁应激理论来解释。此外,我们发现,CX-5461能引起p53磷酸化水平增加。为了研究p53在CX-5461对细胞的影响中是否起作用,我们用特异性p53抑制剂PFT-a(pifithrin-a)预处理血管平滑肌细胞,再给予CX-5461处理,检测CX-5461对细胞周期的影响,流式检测结果显示:PFT-a可以减弱CX-5461对细胞G2/M期的阻滞作用。此外,血管组织的PCR结果显示CX-5461可以明显增加p53靶基因p21CIP/WAFI和GADD45的表达。既往研究表明,p21CIP/WAFI主要调节细胞周期中G1/S期的过渡,而GADD45主要调节G2/M期,因此我们合成表达GADD45 shRNA的腺病毒并将其转入MOVAS中。MTT结果显示:GADD45的shRNA处理可以增加MOVAS增殖的基础水平,而与CX-5461联合应用可以抵消其部分抑制增殖的作用。6.PolⅠ抑制激活血管平滑肌细胞ATM/ATR通路为了研究细胞水平ATM/ATR通路的活化是否参与Pol I抑制,我们用westernblot和免疫荧光对MOVAS和VSMC中ATM/ATR底物结构域S/T*Q的磷酸化水平进行检测,结果显示:CX-5461可以引起细胞ATM/ATR通路的激活。接下来我们分别用ATM特异性抑制剂KU-55933和ATR特异性抑制剂VE-821处理血管平滑肌细胞,发现ATR的抑制剂VE-821可以部分抵消CX-5461阻滞细胞周期以及升高p53磷酸化水平的作用,而ATM抑制剂KU-55933并不能改变CX-5461对细胞的作用。7.PolⅠ抑制导致p53乙酰化增加血管组织的免疫组化染色显示CX-5461处理能使p53乙酰化水平增强。我们也检测了细胞水平CX-5461处理对p53乙酰化水平的影响,结果显示:CX-5461明显增强了 MOVAS和VSMC中p53乙酰化水平。8.CX-5461对人脐静脉内皮细胞增殖及迁移的影响MTT实验结果显示:0.7和14 μ M的CX-5461均能抑制HUVEC增殖,且其作用依赖于给药剂量。划痕实验中,CX-5461处理组和对照组相比,实验结果无明显差异。但在Trans-well实验中,14 μ M CX-5461处理抑制HUVEC迁移。结论1.CX-5461抑制MOVAS增殖,且不引起细胞凋亡增加。2.CX-5461对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用不能完全用经典的核仁应激理论解释,不引起p53稳定但增强其磷酸化、乙酰化水平。3.CX-5461可引起快速增殖的血管平滑肌细胞发生G2/M周期阻滞。4.CX-5461抑制细胞增殖可能通过激活ATR,而非ATM发挥作用。5.CX-5461抑制人脐静脉内皮细胞增殖,但低剂量给药对其迁移影响不明显。研究背景在上一部分论文中,我们发现PolⅠ抑制剂通过诱导细胞周期阻滞来抑制血管平滑肌细胞的增殖,与其在肿瘤细胞中的作用不同,PolⅠ抑制并未细胞凋亡。ATR-p53通路参与介导了 PolⅠ抑制剂抑制细胞增殖的过程,ATR激酶的激活依赖于许多因素,包括DNA断裂或多种不伴随DNA断裂的刺激,包括缺氧、机械刺激、氧化应激等。研究证实,ROS水平升高导致的氧化应激在肿瘤发生和进展过程中发挥重要作用(促进细胞增殖、迁移,增强抗凋亡活性,同时也能引起DNA损伤)。在心血管系统中,血管介入术导致的机械损伤和炎症刺激使血管壁发生一系列应激反应,氧化应激也在其中扮演了重要角色。血管再狭窄的过程中,血管平滑肌细胞发生异常增殖和迁移,而氧化应激可以加速这一过程。氧化应激是内源性的抗氧化物和氧化物失衡,导致活性氧簇(ROS)持续产生导致的。转录因子NF-E2相关因子2(Nuclearfactor-erythroid 2-related factor2,Nrf2)可以通过对抗血管细胞中的氧化应激反应和炎症反应发挥保护细胞的作用。PolⅠ抑制剂能激活血管平滑肌细胞ATR-p53通路抑制平滑肌细胞的增殖,但不引起凋亡,或许是因为细胞中某些保护性通路被激活使细胞得以存活。有证据表明,在Caenorhabditis线虫中通过沉默WDR-46蛋白抑制核仁的正常功能,会激活由SKN-l/Nrf-CEPl/p53通路介导的解毒基因表达。因此,我们推测Pol I抑制剂可能激活血管平滑肌细胞中相关的Nrf2通路,从而保护细胞免于凋亡。研究目的1.研究PolⅠ抑制剂CX-5461对细胞Nrf2通路的影响。2.探索Nrf2在PolⅠ抑制剂CX-5461影响平滑肌细胞凋亡作用中的角色。研究方法1.Hela细胞和MOVAS细胞的培养Hela和MOVAS细胞系均购自美国ATCC公司。细胞用含有10%FBS的DMEM培养基,在37° C、5%CO2的培养箱中进行培养。当细胞密度达约90%时,用0.25%的胰酶消化传代。2.MTT法检测细胞活力将细胞接种于无菌96孔板中,给予不同药物处理,后按照CellTiter 96 Aqueous试剂操作方法,用多酶标仪进行细胞活力检测。3.构建 pGL4.26-ARE 质粒根据ARE序列设计DNA链,且DNA两端分别有Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位点。用以上两种内切酶对载体质粒pGL4.26进行酶切,将DNA片段连入载体片段中,形成含有Luciferase报告基因和Hygromycin B抗性的质粒。4.质粒提取在冰上融化一份DH5a感受态,将质粒与其混合,冰浴30min后置入42°C水浴锅中90s,迅速将其转移至冰上。加入SOC培养基后于37° C摇床中孵育90min。取适菌液铺板,37° C培养过夜。次日挑取单克隆菌株,用LB培养基进行培养12-16h。将收集的菌液离心,用QIAGEN质粒小提试剂盒提取质粒。测得质粒浓度和纯度后储存于-20° C。5.琼脂糖凝胶电泳按照DNA分子量选择配置合适浓度的琼脂糖凝胶。在电泳槽中加满TAE电泳缓冲液,将凝胶放入电泳槽中,有孔的一侧靠近负极。将DNA样品按5:1和DNA loading buffer混合,加入凝胶孔中,以100V恒压进行电泳。电泳结束后UV下观察凝胶。6.DNA回收在UV下,将含有所需DNA片段的凝胶切下,称重后置入1.5ml EP管中。用QIAGEN DNA回收试剂盒回收DNA,检测DNA浓度和纯度,储存于-20°C备用。7.质粒转染接种细胞于无菌培养板中,待密度达约70%进行转染。以24孔板为例,用50 μ l Opti-Mem稀释适量DNA,将2 μ l Lipo2000稀释于等体积的Opti-MEM中,室温孵育5min后将DNA和lipo2000溶液混匀,室温孵育30min。将混合液逐滴加入换用无抗生素培养基的细胞中,继续培养,次日换以新鲜培养基。8.Nrf2-reporter稳定细胞系筛选细胞接种于lOcm培养皿,将构建的质粒瞬时转染入Hela细胞中。48h后换以含有200 μ g/ml Hygromycin B的DMEM培养基进行培养。每日换液,当细胞数目由少变多时,用无菌枪头挑取单个细胞簇至新的六孔板中,继续用含Hygromycin B的培养基进行培养。重复上述步骤挑取细胞簇至新的六孔板中,待细胞状态良好时传代,并冻存细胞株。9.荧光素酶检测将细胞接种于96孔板中,给予不同药物处理后,弃去培养基,用PBS洗涤细胞,每孔加入40 μl裂解液,于-80° C反复冻融3次使细胞完全破裂。将裂解液移入白色96孔板中,每孔加入50μl荧光素酶检测试剂,混匀后用酶标仪检测luciferase水平。10.蛋白免疫印迹提取细胞蛋白并用BCA试剂盒检测浓度,根据样品蛋白浓度调整上样量。经过恒压电泳和恒流转膜后,用5%BSA封闭硝酸纤维素膜,TBST洗涤后4°C过夜孵育Nrf2 一抗。次日用TBST洗膜后,室温孵育相应抗性的二抗2h,用LAS-4000化学发光仪检测。11.Caspase3/7 活性检测将细胞接种于96孔板中,药物处理结束后,加入用DMEM培养基和Caspase3/7试剂1:1混合配置的检测液,37° C孵育30min后,将检测液移入白色96孔板中,用酶标仪检测Caspase3/7活性数值。12.免疫荧光检测将细胞接种于8孔腔式载玻片,药物处理结束后,用冰乙醇固定细胞,5%BSA封闭,4° C孵育Nrf2 一抗过夜,次日37° C孵育相应抗性的594-免疫荧光二抗30min。进行DAPI染色后用共聚焦显微镜进行图像采集。13.统计学分析数据均采用均数±标准差表示。数据分析使用非配对t检验或方差分析以及Newman-Keuls两两检验分析数据。认为P<0.05有统计学意义。结果1.Nrf2-依赖的ARE报告基因质粒及稳定表达细胞系的构建将构建好的pGL4.26-ARE质粒转染入Hela细胞,用Nrf2激活剂sulforaphane处理细胞后,测得luciferase水平升高。加抗生素筛选后得到稳定表达 Nrf2-reporter 的细胞系。用 tert-butylhydroquinone(tBHQ)处理 Nrf2-reporter细胞系,能引起luciferase水平升高。2.PolⅠ抑制剂对Nrf2的影响用PolⅠ抑制剂CX-5461处理Nrf2-reporter细胞,能引起luciferase水平升高,提示Nrf2通路被激活;用CX-5461处理pGL4.26-ARE质粒转染的MOVAS平滑肌细胞,luciferase检测和免疫荧光检测提示CX-5461能激活MOVAS细胞中的Nrf2。3.Nrf2对细胞凋亡的影响用特异性Nrf2抑制剂4F抑制Nrf2后,用CX-5461处理MOVAS细胞,检测Caspase3/7活性。结果提示CX-5461单独处理不引起显著的凋亡,而用Nrf2抑制剂和CX-5461联合处理细胞能引起细胞凋亡水平明显升高。4.其他靶向p53的化疗药物对Nrf2通路的影响除CX-5461外,我们还检测了几种新型的p53通路激活剂对Nrf2的作用。Inauhzin、Tenovin6、BMH-21 处理 Nrf2-reporter 细胞均能引起 luciferase 水平升高,提示以上药物均能激活Nrf2通路。而MI773、JNJ-26754165、Doxorubicin处理不能激活Nrf2。结论1.PolⅠ抑制剂处理能激活血管平滑肌细胞中的Nrf2。2.Nrf2通路的激活可能削弱CX-5461及其他p53通路激活剂引起的细胞凋亡。