背景和目的肺癌是一种常见的高发病率及高死亡率的恶性疾病之一,且不管男性女性,肺癌都是肿瘤性疾病的首要死亡原因。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是最常见的肺癌类型,虽然肺癌发病率很高,但其早期诊断仍很困难,大多数病例明确诊断时已是晚期病变,从而错失最佳手术治疗的适应症。即使分子靶向治疗的临床应用在一定程度上改善了晚期NSCLC的预后情况,但含顺铂（cisplatin,DDP）的两药联合化疗仍然是目前临床应用的主要治疗方案。但顺铂化疗的疗效不佳,且固有耐药和获得性的发生率较高。了解DDP的耐药性机制进而采取针对性治疗对于改善肺癌化疗的现状显得尤为重要。微小RNA（micro RNA,miRNA）是一种长度为19-25个核苷酸的非编码小RNA,可以调节人体中靶mRNA的翻译或降解。miRNA在恶性肿瘤细胞增殖、侵袭和凋亡中起重要作用。多项研究表明miR-203在肺癌等多种肿瘤组织中存在表达水平降低,并可能参与调控肿瘤细胞的生物学行为,且miR-203具备影响人肿瘤细胞中对DDP敏感性的潜力。人类Dickkopf-1（DKK1）基因定位于10q11.2染色体,编码包含266个氨基酸的蛋白质。DKK1是一种分泌型蛋白质,是β-连环蛋白依赖性Wnt信号通路的抑制剂。Wnt信号传导是一条具有可调节干细胞功能,细胞分化,细胞增殖,存活,迁移,发育过程中的极性和成人组织稳态的多功能信号通路,其可介导多种细胞生物学行为,Wnt通路异常与肿瘤发生密切相关。多项研究显示DKK1在肺癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌等多种肿瘤中存在表达水平升高,且具有促进细胞增殖的作用,与肿瘤的不良预后相关,部分研究显示DKK1可影响DDP敏感性。本课题旨在研究化疗敏感性不同的NSCLC组织中miR-203及DKK1的差异性表达,探讨过表达miR-203对NSCLC A549/H460细胞株增殖、凋亡及其顺铂敏感性的影响。本课题分为三个部分:第一部分,miR-203和DKK1在30例顺铂化疗敏感和不敏感的非小细胞肺癌组织中的表达水平分析;第二部分,过表达miR-203对人非小细胞肺癌A549/H460细胞株顺铂敏感性及增殖、凋亡的影响;第三部分,miR-203对DKK1作用机理的初步研究。第一部分miR-203和DKK1在化疗敏感性不同的非小细胞肺癌组织中的表达水平分析方法1.收集30例确诊的晚期NSCLC组织,EGFR、ALK突变阴性,应用含顺铂的两药化疗方案敏感、不敏感病例各15例。2.运用q RT-PCR技术检测肺癌组织中miR-203及DKK1 mRNA的相对表达水平,Western blot技术检测DKK1蛋白的相对表达水平。3.SPSS 21.0软件进行统计学分析,正态分布数据以（（?）±s）表示;两独立样本计量资料的比较采用t检验,两组数据资料的相关性分析采用Pearson相关性分析,检验水准α=0.05。结果1.含顺铂的两药化疗方案不敏感的NSCLC组织中miR-203的相对表达水平较化疗敏感的NSCLC组织更低（P=0.035）;含顺铂的两药化疗方案不敏感的NSCLC组织中DKK1 mRNA的相对表达水平较化疗敏感的NSCLC组织更高（P=0.003）。2.DKK1蛋白在含顺铂的两药化疗方案不敏感的NSCLC组织中的相对表达水平较化疗敏感的NSCLC组织更高（P<0.001）。3.NSCLC组织中miR-203与DKK1 mRNA的相对表达水平呈负相关（R2=0.532,P<0.001）;miR-203与量化后的DKK1蛋白的相对表达水平亦呈负相关（R2=0.510,P<0.001）。第二部分过表达miR-203对人非小细胞肺癌A549/H460细胞株顺铂敏感性及增殖、凋亡的影响方法1.构建、包装pre-miR-203及无关序列的慢病毒重组载体,测定病毒滴度,感染稳定表达萤火虫荧光素酶的NSCLC A549/H460细胞,依据感染情况分为miR-203组,NC组,Blank组,感染后细胞对miR-203表达水平进行鉴定。2.CCK-8法检测不同顺铂浓度（0μM,2μM,4μM,6μM,10μM,20μM）作用24h的三组细胞的吸光度值,根据OD值计算增殖抑制率及顺铂的IC₅₀。3.Anncxinv-FITC/PI双标流式细胞术检测两组顺铂浓度（0μM,4μM）作用24h后细胞的凋亡情况,记录凋亡细胞数;caspase-3/7试剂盒检测两组顺铂浓度（0μM,4μM）作用24h后细胞的caspase-3/7活性。4.过表达miR-203或NC组的A549/H460细胞分别接种于裸鼠腋下,构建肺癌裸鼠移植瘤模型,接种1w后给予腹腔注射顺铂（2mg/Kg,连续5d）,每周应用小动物活体成像仪检测裸鼠荧光信号,接种4w后处死裸鼠剥离瘤体称重。5.采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。满足正态性和方差齐性的多组数据资料的比较采用单因素方差分析,多组数据组内的两两比较采用LSD-t检验;顺铂IC₅₀计算采用正态概率转换法,应用SPSS软件回归分析中Probit程序实现;检验水准α=0.05。结果1.成功构建miR-203及无关序列慢病毒重组载体,miR-203重组慢病毒滴度为1.65×108TU/m L,NC重组慢病毒滴度为2.03×108TU/m L。稳定高表达miR-203的A549/H460细胞株成功构建。2.miR-203组在无顺铂及不同浓度顺铂作用下的增殖抑制率均高于NC组及Blank组（P<0.05）;与NC组及Blank组相较,miR-203组顺铂的IC₅₀值明显降低（P<0.05）。3.miR-203组凋亡细胞数明显高于NC组及Blank组（P<0.05）,4μM顺铂干预下,三组细胞凋亡细胞数均较无顺铂干预时增加,且miR-203组凋亡细胞数明显高于NC组及Blank组（P<0.05）;miR-203组的caspase3/7活性在顺铂组和无顺铂组均明显高于相应的NC组和Blank组（P<0.05）。4.高表达miR-203的顺铂化疗组裸鼠移植瘤荧光信号及瘤体重量均显著低于其他组别（P<0.05）。第三部分miR-203对DKK1作用机理的初步研究方法1.生物学信息方法预测miR-203的靶基因,寻找其与靶基因的"seed region",在靶基因的"seed region"设计点突变。2.构建野生型及突变型DKK1 3’UTR双报告重组载体pmir GLO-DKK1-Wt/Mt,分组转染入A549/H460细胞,48h后进行双报告基因荧光素酶信号检测;应用western blot方法检测过表达miR-203对DKK1蛋白表达水平的影响。3.分别或共同转染DKK1-si RNA与miR-203入A549/H460细胞,转染24h给予不同浓度顺铂处理,处理后24h后应用CCK-8法进行细胞增殖检测,计算IC₅₀。4.构建不含3’UTR的pc DNA3.1-DKK1重组表达载体,单独或与miR-203共同转染入A549/H460细胞,并给予不同浓度顺铂处理,24h后应用CCK-8法进行细胞增殖检测,计算IC₅₀。5.采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。结果1.生物学信息方法预测显示,DKK1可能是miR-203的靶基因。2.pmir GLO-DKK1-Wt/Mt重组载体成功构建,miR-203+pmir GLO-DKK1-Wt组的荧光素酶信号较另三组（miR-203+pmir GLO-DKK1-Mt,NC+pmir GLO-DKK1-Wt,NC+pmir GLO-DKK1-Mt,）均明显降低（P<0.05）,余三组的荧光素酶信号差异无统计学意义;上调miR-203可降低DKK1蛋白的表达水平。3.与Scramble组相较,miR-203组、DKK1-si RNA组、DKK1-si RNA+miR-203组的IC₅₀值均明显降低（P<0.05）,且后三组之间比较,其IC₅₀值差异无统计学意义。4.pc DNA3.1-DKK1重组表达载体成功构建;与Scramble组相较,miR-203组细胞IC₅₀值明显降低（P<0.05）,pc DNA3.1-DKK1组和pc DNA3.1-DKK1+miR-203共转染组细胞IC₅₀值均明显升高（P<0.05）,后两组细胞间的IC₅₀值差异无统计学意义。结论1.miR-203在含顺铂二联化疗不敏感的NSCLC组织中表达水平较敏感组织更低,DKK1 mRNA及DKK1蛋白在含顺铂二联化疗不敏感的NSCLC组织中表达水平较敏感组织更高。miR-203与DKK1表达水平呈负相关。2.过表达miR-203可增加NSCLC A549/H460细胞对顺铂的敏感性,抑制A549/H460细胞增殖,促进其凋亡。3.miR-203通过作用于DKK1的3’UTR区对其产生负调控作用,进而增加A549/H460细胞株对顺铂的敏感性。