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猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种猪的接触传染性呼吸道疾病,主要引起肺的纤维性渗出、坏死性肺炎及肺膜的增厚炎性渗出,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前疫苗接种仍然是预防控制该病的主要措施,因而获取一种针对胸膜肺炎放线杆菌安全、高效、具备良好的交叉保护力的疫苗拥有极大的前景。弱毒活疫苗免疫动物后可诱导机体产生免疫力,可获得一定的对异型血清型菌的交叉保护力。主要研究内容如下。1、五基因缺失疫苗菌株构建及生物学特性的研究本研究通过接合转移和同源重组等方法在四基因缺失疫苗菌株CH04(△apxIC/△apxⅡC/△apxⅣ-orfl/△cpxAR)的基础上,进一步敲除了areA双组份基因,成功构建五基因缺失疫苗菌株YWJ05(△apxIC/△apxlIC/△apxⅣ-orfl/△cpxAR/△arcA),生长速率结果表明：较之CH04和APP血清1型野毒(WT,下同)菌株,YWJ05菌株的生长速率下降不显著。在体外采用PK-15细胞进行粘附和侵入试验,在肺泡巨噬细胞内检测细菌的抗吞噬能力,运用中心粒细胞介导杀伤试验(PMN)来了解两个突变株的抗杀伤能力的不同,细胞试验的结果表明：YWJ05菌株的抗杀伤能力低于CH04菌株。2、五基因缺失疫苗菌株对小鼠毒力分析为了比较关于两个突变株对小鼠毒力差异,每个菌使用四个浓度,每个稀释度腹腔接种6只Balb/C小鼠,每只200μL,然后通过统计各突变株感染小鼠后10天后的存活数量,计算LD5o。LDso结果表明YWJ05菌株的毒力相对于CH04菌株,差异不显著,但较之野毒,下降则极为显著。3、五基因缺失疫苗菌株对小鼠免疫保护力研究为了解淋巴细胞的增殖情况,我们提取二免后七天小鼠的脾脏来进行淋巴细胞增殖试验,结果发现YWJ05疫苗菌株免疫组OD490比值明显低于CH04疫苗菌株免疫组,取二免7天后小鼠血清和WT孵育,再与空白小鼠全血作用,发现YWJ05组杀伤率明显高于CH04组,说明YWJ05菌株诱导抗体的表达有相当程度地提高。通过ELISA检测免疫后14、28天小鼠血清中的ApxⅣA抗体,结果YWJ05组的抗体滴度高于CH04,这与全血杀菌的结果吻合。对二免后7天小鼠血清进行抗体分型检测,结果两个疫苗菌株都呈现IgG1抗体水平明显高于IgG2a,这表明突变株在体内主要引起Th2型为主的免疫反应。再通过检测淋巴细胞培养上清细胞因子水平,发现两个突变株组的IL-6、TNF-a水平都有明显提高,而且突变株组的IL-6的表达上升比值都高于TNF-α的表达上升比值,说明两个突变株在小鼠体内激发体液免疫反应,这与抗体分型的结果一致。在二免后14天,以APP血清1型野毒株3X107CFU(30LD50)攻毒,观察14天,记录下每组的死亡情况,发现CH04、YWJ05组的免疫保护率都高达100%,说明在敲除了arcA基因后,YWJ05疫苗菌株依然可以提供很好的免疫保护力。将免疫攻毒后7天小鼠的肺脏经福尔马林充分固定好后,制作肺部的石蜡切片,结果表明YWJ05组免疫小鼠后,当再受到野毒感染时,其肺脏的病变非常轻微。