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钛由于具备优良的机械和生物学性能已广泛应用于制作骨科与牙种植体,但由于其表面骨整合形成率较低,易引起种植体周围炎,其远期愈后及稳定性较差。如何能够改善钛种植体的组织相容性,使其具备一定的促成骨功能以加速骨整合目前已经成为骨组织工程领域的研究热点。对种植体材料表面拓扑结构进行优化设计可为机体细胞产生积极应答提供有利环境。二氧化钛纳米管阵列由于形态有序、管径可控、具备较高表面亲水性以及利于蛋白吸附等特征受到越来越多学者的关注。但针对不同管径大小对细胞成骨向分化等多种生物学行为的影响目前尚无定论。此外,细胞感受来源于材料表面结构的机械刺激并产生生物应答这一过程取决于细胞的粘附状态,后者涉及到黏着斑激酶及细胞骨架调控蛋白相关机械信号传导机制的激活,但关于该机制如何对细胞形态、增殖及分化进行调控,其下游信号转导途径及亚细胞水平变化等问题的研究尚不清晰。目的:1.观察不同管径二氧化钛纳米管表面细胞的生物学行为变化;2.探讨钛纳米管对细胞增殖能力的影响及其内在机制;3.探寻黏着斑激酶家族在纳米管拓扑结构促细胞成骨过程中的作用;4.考察FAK、Rho A和YAP之间的相互关系及三者在细胞粘附及分化过程中所发挥的作用。方法:以阳极氧化法制备在钛片及钛种植体表面制备二氧化钛纳米管。1.扫描电镜与原子力显微镜观察其表面形貌及粗糙程度;分别在光滑面纯钛和不同管径纳米管材料表面培养MC3T3-E1细胞,激光共聚焦显微镜观察黏着斑及细胞骨架形成情况;以5-溴脱氧尿嘧啶核苷法(Brd U)测定细胞增殖能力,Real-time PCR检测其成骨相关基因表达水平,能谱分析细胞基质成分,Micro-CT扫描和组织切片染色考察表面修饰纳米管的种植体在体内促成骨效应。2.流式细胞仪检测不同材料表面细胞周期变化,免疫印迹(Western blot)考察胞内黏着斑激酶(FAK)、细胞骨架调控蛋白(Rho A)表达水平,Brd U测定黏着斑激酶活性抑制剂、细胞骨架调控蛋白抑制剂C3及其效应因子(Rock)抑制剂Y27632对细胞增殖能力的影响,非线性回归分析评估各调控蛋白表达水平与细胞增殖的相关关系。3.Western blot考察不同材料表面细胞PYK2及p-PYK2蛋白表达水平,质粒转染建立FAK、PYK2及FAK+PYK2基因过表达模型,si RNA干扰建立FAK、PYK2及FAK+PYK2基因敲减模型,Real-time PCR检测不同细胞模型的成骨相关基因表达水平。4.Image J软件计算分析相同单位面积内的细胞可粘附区域差异;激光共聚焦显微镜观察YAP亚细胞分布;免疫共沉淀法考察细胞黏着斑内FAK募集水平差异;免疫pull-down检测Rho A活性变化;免疫印迹法和荧光素酶测定法考察细胞核内、外YAP表达差异;质粒转染建立YAP基因过表达细胞模型;Real-time PCR检测Rho A活性增强、抑制,以及YAP过表达对细胞成骨相关基因表达的影响。结果:不同电压制备出的二氧化钛纳米管管径分别为40nm(STNTs)和150nm(LTNTs)。1.与光滑面纯钛(Flat Ti)相比,STNTs和LTNTs表面细胞伸展面积均减小(P<0.05),形态长宽比均增大(P<0.05),其中LTNTs变化最为显著(P<0.05);培养1天时LTNTs组细胞增殖水平明显高于其他组(P<0.05),7天时STNTs和LTNTs组均下降(P<0.05)。与Flat Ti相比,LTNTs和STNTs表面细胞分别在培养4天和21天时出现成骨相关基因表达水平升高(P<0.05),其中LTNTs组升高最为显著(P<0.05);能谱分析结果显示LTNTs和STNTs组细胞基质中均出现钙元素;Sprague-Dawley大鼠体内植入14天时,大孔径纳米管修饰的种植体组周围骨体积分数和骨小梁数量均明显高于光滑面种植体组(P<0.05)。2.LTNTs组细胞培养1天时处于S期的细胞所占比例高于另外两组(P<0.05);LTNTs和STNTs组细胞中FAK、p-FAK和Rho A表达水平均明显低于Flat Ti组(P<0.05),且下降程度以LTNTs组最为显著(P<0.05),但该组细胞的Rho A/FAK相对蛋白水平较另外两组显著升高(P<0.05);LTNTs组细胞在加药黏着斑激酶抑制剂PF573228培养1天时增殖能力仍然最高(P<0.05),Rho A活性抑制剂C3以及C3+PF573228同时加药后比例均显著下降(P<0.05),Rock抑制剂Y27632加药后增殖能力显著低于Flat Ti组(P<0.05);与MC3T3-E1细胞在不同材料表面增殖能力相关性最大的指标为Rho A/FAK相对蛋白表达水平(P=0.0017)。3.LTNTs组PYK2和p-PYK2表达较Flat Ti组和STNTs组显著下降(P<0.05);质粒转染FAK、PYK2及FAK+PYK2过表达基因后,细胞内FAK与PYK2蛋白表达水平较对照组明显增高(P<0.05);si RNA对FAK、PYK2及FAK+PYK2进行基因敲减后,细胞内FAK与PYK2蛋白表达水平较对照组明显减低(P<0.05);LTNTs表面PYK2过表达细胞的成骨相关基因表达水平显著低于对照组(P<0.05)。4.三种材料表面的细胞可粘附区域的面积、黏着斑内FAK募集水平、GTP-Rho A表达水平及YAP胞核内表达量随纳米管管径增加而递减(P<0.05);Flat Ti表面细胞充分伸展时,黏着斑及细胞骨架纤维数目多、分布广,STNTs上细胞伸展面积缩小时黏着斑与细胞骨架纤维数目减少,仅在细胞周边局部区域可见;LTNTs表面细胞周边黏着斑与骨架纤维进一步减少,仅分布于丝状伪足凸起处;PF573228加药后胞内活性Rho A(GTP-Rho A)表达量下降(P<0.05);C3加药后成骨相关基因表达明显升高(P<0.05);细胞在LTNTs表面过表达YAP或加入Rho A活性增强剂CN01后,胞核内YAP分布增加,成骨相关基因表达明显降低(P<0.05)。结论:本实验成功制备出两种孔径的纳米管;1.与Flat Ti相比,STNTs表面细胞面积减小,形态伸长,呈现一定的成骨向分化能力;LTNTs表面细胞伸展面积进一步缩减,形态趋于梭形,细胞生长水平随时间递减,但在培养早期具备较高的增殖能力,体内与体外实验均证实其具备较高的促成骨效应。2.LTNTs对细胞早期增殖有促进作用,当其拓扑结构抑制细胞内FAK表达水平时,细胞骨架蛋白调控因子Rho A相关信号通路对其增殖能力的维持或促进发挥重要影响作用。3.LTNTs表面细胞内FAK及PYK2蛋白表达同时受到抑制,但PYK2的低水平表达对细胞成骨向分化有正向调控作用。4.LTNTs拓扑结构为细胞提供的可粘附面积较Flat Ti和STNTs表面显著减小,MC3T3-E1细胞在其表面粘附面积受限,黏着斑内FAK募集水平下降,黏着斑与细胞骨架形成障碍,Rho A活性减低,YAP亚细胞分布集中在细胞浆,细胞成骨向分化能力高,从亚细胞水平验证YAP作为FAK/Rho A机械传导通路的下游信号因子对大孔径纳米管表面细胞形态改变及成骨向分化行为有重要调控作用。本实验通过观察不同纳米管管径对细胞生物学行为的影响,针对纳米管表面细胞形态、增殖及分化的相关信号转导通路及其相互之间的关系进行研究,为筛选纳米管管径进而提高其促成骨效应提供依据,为后期细胞生物应答相关机制的研究奠定材料基础。除提出FAK/Rho A机械传导通路在纳米管改变细胞增殖水平过程中的作用以外,本研究发现PYK2对纳米管诱导鼠前体成骨细胞分化有重要调控作用,同时从亚细胞水平(YAP活性变化)为材料表面拓扑结构优化设计提供分子生物学基础。