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研究背景支气管哮喘是一种慢性气道炎症疾病,包括嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞及肥大细胞等多种炎性细胞及炎性介质共同参与其发病机制。据统计全球大约有3亿支气管哮喘患者,少数国家哮喘的患病率高达18%。支气管哮喘已经成为严重影响人民身心健康疾病之一,它不仅直接带来巨大的医疗经济负担,同时由于疾病导致丧失劳动力甚至死亡所产生的间接经济负担更是难以估量。全球哮喘防治创议(Global Initiative for Asthma, GINA)指出,支气管哮喘患者不仅存在气道炎症,同时还可以观察到气道结构特征性改变即气道重塑。哮喘气道重塑包括：粘液分泌增加、上皮下纤维化、平滑肌增厚、血管过度增生等,这些改变往往导致气道不可逆狭窄,并且与哮喘严重程度有关。其中,上皮下纤维化及基底膜增厚(reticular basement membrane, RBM)是哮喘气道重塑重要特征之一。研究发现,哮喘患者肺成纤维细胞(human lung fibroblasts-1, HLF-1)在慢性炎症刺激下激活并转化成为肌成纤维细胞,后者产生大量炎症介质,同时释放纤维连接蛋白1(Fibronectin1,FN1)及I型胶原蛋白(type I collagen, COL-I)导致哮喘气道上皮下纤维化并基底膜增厚。白细胞介素-33(interleukin-33, IL-33)是新近发现的白介素-1超家族成员,它最初被发现于高壁内皮细胞核内,主要来自受损的上皮细胞。体外实验发现,IL-33能够与TH2(helper T cell2)细胞表面受体(ST2)结合,通过复杂的信号传导途径,释放IL-4、IL-5及IL-13等炎性因子。IL-33还能够与肥大细胞表面ST2结合,促进肥大细胞前体的成熟,参与哮喘气道炎症形成。新近研究发现一类固有免疫淋巴细胞如nuocytes在IL-33或IL-25刺激下,能够释放IL-5及IL-13细胞因子参与哮喘免疫应答过程。IL-33发现时间较短,其与支气管哮喘病情严重程度相关研究较少,在哮喘气道重塑中的参与机制还不清楚。基于上述目的,本实验通过临床中观察哮喘患者血清IL-33与哮喘严重程度的相关性,进一步在体外实验中探讨IL-33对肺成纤维细胞表达胶原蛋白的诱导作用,探讨工L-33参与哮喘气道重塑的作用机制。本课题从以下两个部分进行阐述。第一部分哮喘患者血清IL-33与疾病严重程度的相关性研究目的本研究通过对临床哮喘患者血清IL-33检测及哮喘疾病严重程度的评价,初步探讨IL-33在哮喘患者中检测的临床意义。方法随机选取哮喘患者45人(哮喘组)及健康对照者40人(对照组),对两组病人行血清IL-33、血清总IgE、诱导痰嗜酸性粒细胞计数、肺功能检测。哮喘组患者疾病严重程度进行评价。8例哮喘患者及对照者行电子气管镜下粘膜活检,HE染色计算粘膜下基底膜厚度,粘膜组织行IL-33免疫组化检查。结果1哮喘组及对照组血清IL-33、血清IgE、诱导痰嗜酸性粒细胞计数、肺功能检测结果哮喘组及对照组清晨空腹血清IL-33水平分别为903.62±523.78pg/ml和158.1±81.74pg/ml,哮喘组血清IL-33水平较对照组明显升高(P<0.01)。哮喘组及对照组血清总IgE水平分别为86.95(17.8-709) IU/ml和31.50(14-156) IU/ml,与对照组比较,哮喘组血清IgE水平明显升高(P<0.05)。哮喘组诱导痰嗜酸性粒细胞计数为21%(4%-50%)。哮喘组及对照组肺功能检查结果FEV1(%predicted)分别为64.32±18.33%和86.12±11.47%,较对照组明显下降(P<0.01)。2粘膜组织活检病理学检查活检组织HE染色结果显示哮喘患者气道纤毛倒伏,上皮细胞破损,上皮下基底膜(reticular basement membrane, RBM)明显增厚。哮喘组与对照组基底膜厚度分别为7.17(2.5-10.25)和3.29(1.21-6.15)μm,且具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果显示IL-33主要分布于受损的上皮细胞,与对照组比较,哮喘患者气道粘膜上皮细胞表达IL-33明显增强(P<0.01)。3哮喘组血清IL-33水平与血清IgE、诱导痰嗜酸性粒细胞计数、肺功能FEV1(%predicted)、疾病严重程度及基底膜厚度的相关分析结果相关分析结果显示哮喘患者血清IL-33与血清IgE及诱导痰嗜酸性粒细胞计数无明显相关性,但哮喘患者血清IL-33水平与肺功能FEV1(%predicted)成负相关(rs=-0.571,P<0.01)。与严重程度成正相关(rs=0.691,P<0.01)。哮喘患者血清IL-33水平与RBM厚度成正相关性(rs=0.831,P<0.05)。结论上述研究结果表明,哮喘患者血清及组织中IL-33明显升高,且哮喘患者血清IL-33与肺功能及疾病严重程度相关,提示我们IL-33确实在哮喘发病机制中发挥重要的作用。IL-33是评价哮喘疾病严重程度的重要生物学标志。IL-33与基底膜厚度相关分析提示IL-33可能参与哮喘气道重塑,导致基底膜增厚。第二部分IL-33/ST2在支气管哮喘气道重塑中的机制研究目的本研究通过体外培养肺成纤维细胞(human lung fibroblasts-1, HLF-1),检测IL-33刺激下HLF-1表达纤维粘连蛋白1(Fibronectin1,FN1)及Ⅰ型胶原蛋白(type I collagen, COL-I),初步探讨IL-33/ST2途径在支气管哮喘气道重塑中的作用机制。方法在体外实验,对人肺成纤维细胞进行培养。采用real-time per及western blot方法检测HLF-1表达ST2的水平。同时分别给予不同浓度IL-33细胞因子刺激,通过real-time pcr及western blot方法检测FN1和COL-I基因及蛋白的表达。结果1IL-33刺激诱导HLF-1表达IL-33受体(ST2)体外培养HLF-1通过western blot方法检测显示HLF-1组成性表达ST2。Real-time pcr方法检测不同浓度IL-33刺激下,HLF-1表达ST2成浓度依赖型增强,且具有统计学意义(P<0.01)。2IL-33/ST2途径参与气道重塑体外培养HLF-1分别给予1-100ng/ml不同浓度的IL-33细胞因子刺激下,FN1和COL-I的表达在基因及蛋白水平均成浓度依赖型增强,且具有统计学意义(P<0.05)。提前给予10μg/ml ST2中和抗体or100nm丙酸氟替卡松(fluticasone propionate, FP)可以抑制IL-33诱导表达FN1和COL-I,且具有统计学意义(P<0.05)。结论上述研究结果表明,在体外实验IL-33刺激胶原成分表达,提示我们IL-33在哮喘气道重塑作用机制中发挥了重要的作用,而且这一作用是通过激活人肺成纤维细胞表达受体ST2完成的。本实验希望通过上述研究为将来支气管哮喘气道重塑新的治疗方法提供了有力的理论依据。