心脏胚胎发育是一个非常复杂的过程,受到遗传与非遗传因素的共同影响。随着人居污染逐渐加剧,其最常见的污染因素甲醛对胚胎各系统发育的影响已成为研究热点。目前,主要研究了甲醛对生殖系统、造血系统、消化系统、泌尿系统、神经系统等系统的影响,但其对心脏胚胎发育的影响尚未见明确报道。本课题立足临床工作,首先,通过临床流行病学回顾性研究,探讨常见的围孕期危险暴露因素与先天性心脏病之间的相关关系。随后,我们针对目前生活中非常普遍的环境污染源-甲醛,进一步探讨围孕期甲醛暴露污染对心脏胚胎发育影响的发病机制。本课题以研究甲醛暴露性污染对心脏胚胎发育的影响为目的,在孕前13天对SD大鼠给予甲醛吸入染毒,以胎鼠及子鼠为研究对象,通过超声、组织学、分子生物学等方法,在甲醛吸入性暴露污染条件下,对心脏胚胎发育的影响进行系列观察,分别从胎鼠/子鼠存活性、心脏胚胎发育异常的发生、发展的大体水平、细胞学水平、基因差异性表达等多方进行综合分析,探索甲醛与心脏胚胎发育之间的关系,并探讨其发病机制。该课题的研究结果将对深入了解人居环境污染中的常见因素与心脏胚胎发育的关系、提高优生优育一级预防、降低出生缺陷有重要意义。实验一围孕期危险因素暴露与先天性心脏病发病的临床流行病学观察目的探讨先天性心脏病的发病与围孕期危险因素暴露之间的相关性。方法选择2012年3月1日至2013年10月1日在第四军医大学进行超声心动图检查确诊为先天性心脏病的435例5岁以下幼儿及574例正常体检的儿童家庭作为观察对象,对其家庭一般情况及围孕期有毒环境因素暴露情况进行问卷调查(观察内容:儿童一般情况、父母年龄、职业、受教育程度、母亲怀孕期间药物接触史、母亲怀孕期间病毒感染史、孕期房屋装修史、孕期母亲染发烫发史以及父母亲工作环境中是否存在污染)。对采集的数据予以数量化和分级,输入SPSS 13.0数据库,经逻辑校对无误后应用Χ2检验,非条件Logistic回归分析方法进行资料分析。结果1.患病组幼儿体重低于健康对照组(P<0.01),但两组受检者在年龄、身高、心率及父母年龄方面差异均无统计学意义。2.父母的受教育程度在先天性心脏病患病组与健康对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),且先天性心脏病组中父亲及母亲高中及以下受教育程度的比例明显高于健康对照组(父亲:86.7%vs 67.4%,母亲:83.5%vs 66.4%)。3.母亲怀孕早期服用药物、病毒感染、房屋装修、母亲怀孕期间或孕前半年内染发烫发、父母工作环境污染暴露均是造成先天性心脏病的独立危险因素。其中孕早期服用药物的危害性最大(p<0.0001,OR=5.06)。4.经过多因素Logistic Regression分析,接触药物、病毒感染、房屋装修、烫发染发及工作环境暴露显示出与先天性心脏病发病有显著的相关关系。5.随着暴露因素的增多,先天性心脏病发病的危险程度显著增加。当孕期同时受到3种或3种以上危险因素的暴露时,新生儿罹患先天性心脏病的危险性几乎是单因素暴露的16倍。6.圆锥干畸形和单纯室间隔缺损是本研究中显示的发病率最高的先天性心脏病。药物、工作环境暴露和病毒性感染均与圆锥干畸形有很高的相关性(P<0.01,OR值分别为6.74、3.73、2.82)。药物、病毒感染、房屋装修、烫发染发及工作环境暴露均会增加单纯室间隔缺损的罹患风险(OR值分别为2.77、2.07、1.76、1.89、1.81)。结论围孕期多种危险因素暴露与先天性心脏病发病存在显著的相关关系。实验二围孕期甲醛暴露污染对大鼠心脏胚胎发育的影响及其发病的研究目的探讨围孕期甲醛吸入性暴露对SD大鼠心脏胚胎发育的影响及其发病机制。方法1.围孕期甲醛吸入性染毒动物分组选取了12只SD大白鼠作为实验动物,随机分为两组:第一组为空白对照组(不做任何处理);第二组为交配前13d甲醛吸入组(E-13);甲醛吸入浓度为3mg/m3,每天一次,每次90分钟。2.围孕期甲醛吸入性染毒母鼠一般状况评估对两组动物在整个实验过程中进行一般情况的评估,包括体重、进食、饮水、精神状态。同时,在孕14天通过超声检查确定胎盘数,实验结束取样时计算存活胎数。3.观察甲醛暴露污染对子鼠心室间隔、瓣膜、血流以及室壁运动功能的影响将出生后子鼠从笼中取出称重,按0.18m L/l0g重量给予三溴乙醇注射麻醉,将其置于检查台上,操作台上温度设定为40℃左右,用医用胶布将其固定于操作台上,用RMV707B高频超声探头以及Vevo770操作系统观察间隔、瓣膜、血流及心脏功能情况。4.心肌标本制备依照SD大鼠的平均妊娠周期约20天,在妊娠后14天随机选取3只雌鼠,获得胎鼠心脏样本;余3只雌鼠待胎鼠出生后,获得子鼠心脏样本,所有样本均在无菌无酶条件下,切取心肌组织,灭菌生理盐水冲洗后,离体1min内迅速置于冻存管内,3min内转至液氮罐中保存。5.心肌组织电镜标本制备将心肌组织放在干冰上切成直径约5mm,高度约3-5mm之间的标本,迅速放入2%戊二醛溶液中2小时,用磷酸缓冲液清洗6次,用0.1%锇酸清洗3次,再用双蒸水清洗3次,放入梯度酒精脱水2次,用真空喷镀仪干燥,再用导电胶将标本固定在金属样品台上,最后放入真空喷镀仪内镀膜备用。6.心肌组织基因功能检测标本制备将心肌组织放入盛有液氮的研钵中研磨成粉状,加入50mg组织至1ml Trizol试剂继续研磨,待液氮挥发后装入EP管中,室温下静置5min,离心半径15cm,放入离心机内以12000r/min离心10-15min,留取上层液体,将Trizol加入异丙醇(用0.5ml/1ml比例),室温下静置10-15 min,再重复上述操作。然后将上清液弃掉,1ml体积分数75%乙醇漂洗,4℃,离心半径15cm,8 000r/min离心×5min。室温晾干,50ul DEPC水溶解,置于-20℃备用。结果1.与正常对照组相比,实验组母鼠在接受甲醛暴露接触后基本生命体征(体重、进食、排泄及运动情况)均未出现显著变化;2.交配前13d甲醛吸入组(E-13)与正常对照组相比,母鼠受孕周期明显延长(360±8h vs 14±3h,p<0.001);子鼠活产胎数减少(9±2 vs 24±2,p<0.001);3.子鼠出生后20天高频小动物超声心动图检查显示,各组活体子鼠中并未发现明显的心脏胚胎发育异常和功能异常。4.与其他各组相比,交配前13d甲醛吸入组子鼠的心肌组织均出现了不同程度的细胞水肿、细胞间距增宽等变化。5.基因芯片结果显示,交配前13天甲醛吸入组胎鼠混合样本与正常对照组样本相比,有25种与心脏发育相关且明显上调的基因:IRX4,DLC1,PAM,BMP10,ERBB4,MYL3,MYBPC3,FHL2,GJA1,GJA5,EDNRA,HAND2,GATA6,GATA4,CALCRL,NKX2-5,MB,BMP4,MYH7,MYH6,MECOM,MYH11,HOPX,NPPB,ADAMTS1,且其上调倍数均大于3倍。6.显著上调的与心脏发育及功能相关的基因分别参与了5种重要的信号通路的传导。结论1.围孕期甲醛吸入性暴露可致母鼠受孕周期延长。2.围孕期甲醛吸入性暴露可显著降低子鼠的活产率,但正常活产的子鼠其心脏大体结构与功能并未发现显著性异常。3.围孕期甲醛吸入性暴露可致子鼠心肌组织细胞超微结构发生变化。4.围孕期甲醛吸入性暴露对大鼠心脏胚胎发育相关基因的差异性表达可产生影响。