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研究背景:生殖支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)是由Tully等于1981年分离到的一种支原体。它是一类缺乏细胞壁但能够自我复制的最小原核细胞型微生物。Mg经由其膜蛋白结合在宿主细胞膜上,是介导Mg致病的基础。生殖支原体黏附蛋白(M.genitalium protein of adhesion,MgPa)是含量最多的膜蛋白,Mg可能经MgPa黏附或侵入宿主细胞从而引起致病。本课题组前期研究表明人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)膜上的亲环蛋白(Cyclophilin A,CypA)是MgPa的受体蛋白,MgPa与其受体特异结合能介导Mg侵入宿主细胞,但其具体的致病机制尚未阐明。本课题旨在研究MgPa与宿主细胞膜上的CypA相互作用后对宿主细胞的影响,并揭示其可能的信号通路,从而为Mg的防治提供新的思路和靶点。研究目的:研究MgPa诱导SV-HUC-1分泌的胞外CypA(eCypA)与CD147相互作用,进而经ERK1/2-NF-κB通路诱导细胞分泌促炎症因子,以阐释Mg可能的致病机制。研究方法:(1)免疫印迹实验(Western blot,WB)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MgPa诱导细胞分泌eCypA蛋白的水平;(2)WB和间接免疫荧光法检测MgPa不同时间诱导CypA和CD147的表达情况;(3)间接免疫荧光法和免疫共沉淀法验证CypA-CD147的相互作用;(4)WB检测CypA-siRNA、CD147-siRNA转染细胞后的表达水平;(5)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和ELISA检测MgPa处理细胞不同时间后促炎症因子的表达水平;(6)WB检测eCypA对细胞ERK、JNK、P38和IκBα蛋白的磷酸化水平的影响;(7)间接免疫荧光法和WB检测NF-κB P65的核转位;(8)ELISA和RT-qPCR检测JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂PD98059、NF-κB抑制剂BAY11-7082和p38抑制剂SB202190对MgPa诱导细胞产生促炎症因子的影响。研究结果:(1)不同浓度的MgPa刺激细胞后,其eCypA的量逐渐增多,且MgPa浓度为20μg/mL时达到峰值,此为最适的刺激浓度;(2)WB和ELISA的结果表明MgPa能诱导细胞表达CypA和分泌eCypA,且随时间的延长而逐渐增加,在32h时达到峰值;(3)间接免疫荧光试验的结果表明CypA和CD147的表达量随刺激时间延长而增加,在刺激24h时表达量最高;(4)间接免疫荧光法和免疫共沉淀试验的结果表明在MgPa诱导下CypA和CD147能在SV-HUC-1细胞中共定位;(5)WB的结果表明CypA-siRNA和CD147-siRNA转染细胞后能干扰CypA和CD147的表达;(6)不同浓度的MgPa能诱导IL-1β,IL-6,TNF-α和MMP-9蛋白及其mRNA的表达增加;(7)SV-HUC-1细胞转染CypA-siRNA、CD147-siRNA后可明显抑制IL-1β,IL-6,TNF-α和MMP-9的表达;(8)MgPa诱导细胞IκBα和p-ERK磷酸化水平明显增加;(9)WB和间接免疫荧光试验的结果表明MgPa诱导SV-HUC-1细胞的p65发生核转位。(10)NF-κB抑制剂和ERK抑制剂预处理细胞后可明显抑制IL-1β,IL-6,TNF-α和MMP-9的蛋白与mRNA的表达。结论:生殖支原体MgPa能诱导SV-HUC-1细胞分泌eCypA,并经CypA-CD147-ERK-NF-κB信号通路诱导SV-HUC-1细胞表达促炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α和MMP-9。