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淀粉是植物籽粒中的主要储存物质,广泛运用于饲料、燃料、工业和建筑等领域,在经济的发展过程中担任着十分重要的作用。玉米淀粉作为最好的淀粉之一,占世界淀粉产量的80%左右,且玉米中淀粉含量占籽粒比重的70%左右,籽粒中淀粉的生物合成会直接影响到玉米的产量和品质。因此,研究玉米淀粉生物合成的分子机制具有重要意义。
研究发现植物中bZIP家族转录因子参与种子成熟、种子发芽、花的发育、植物衰老、植物抗逆和光信号等多种生物学过程。目前,关于ABA介导的信号传导途径方面的研究已成为热点。ABA在植物种子的发育以及灌浆过程中起着重要的调控作用。但是ABA作为信号分子调控玉米淀粉合成基因的表达的研究较少。课题组前期的研究表明,ABA能调控玉米淀粉生物合成相关基因的表达,但调控的机制尚不清楚。
前期研究中,对玉米自交系B73授粉后10d的胚乳进行ABA处理,利用RNA-Seq高通量测序技术对处理后的玉米胚乳转录组进行测序。通过对转录组数据的分析,发现了23个有显著性差异表达的bZIP家族转录因子,同时通过生物信息学对显著性差异表达的基因做预测,初步筛选了8个转录因子作为候选基因,本研究主要是对候选转录因子ZmbZIP104进行重点分析,采用亚细胞定位(基因枪轰击洋葱表皮细胞和玉米叶片原生质体)、RT-PCR、半定量PCR、玉米胚乳瞬时过表达、酵母激活、酵母单杂交以及原核表达等实验,研究分析ZmbZIP04基因的表达模式,自身特性,与玉米淀粉合成关键酶基因启动子之间的相互作用模式,初步探究该基因的功能。具体结果如下:
1.用玉米自交系B73授粉后10d左右的胚乳cDNA为模板,从中克隆得到ZmbZIP104基因,对其蛋白序列进行生物信息学分析。结果发现ZmbZIP104基因cds序列为996bp,含有331个氨基酸,编码34.9358kD蛋白质,而且具有典型的bZIP蛋白结构域,是一个bZIP家族的转录因子;
2.对ZmbZIP104基因的表达模式进行了分析。半定量PCR结果显示ZmbZIP104基因在玉米胚乳中表达较高;实时荧光定量RT-PCR表明ZmbZIP104基因在籽粒发育的整个时期均有表达且在种子授粉后12d表达量最高。同时通过实时荧光定量RT-PCR分析了ABA对ZmbZIP104基因表达的影响,其结果与测序分析结果一致,ABA抑制ZmbZIP104基因的表达。进一步实验,对授粉后10d的胚乳进行ABA时间梯度的处理,结果表明ABA处理时间为3h时,ZmbZIP104基因表达量最低;对授粉后10d的胚乳进行ABA浓度梯度的处理,结果表明ABA处理浓度为25μM时,ZmbZIP104基因表达量最低。
3.基因枪轰击洋葱表皮细胞和玉米叶片原生质体分析ZmbZIP104基因编码蛋白的亚细胞定位,结果表明ZmbZIP104基因编码的蛋白质只定位于细胞核,说明ZmbZIP104在植物细胞核内参与转录调控的生理过程;通过酵母激活实验来分析ZmbZIP104的转录活性,结果表明ZmbZIP104基因编码的蛋白不具有转录激活活性。
4.通过玉米胚乳瞬时过表达和酵母单杂交实验研究转录因子ZmbZIP104与淀粉合成关键酶基因启动子之间的相互作用。玉米胚乳瞬时过表达结果表明转录因子ZmbZIP104基因能抑制Sh2基因启动子活性,促进GBSSⅠ、SSⅢa以及SBEⅡb基因启动子活性;酵母单杂交结果表明ZmbZIP104基因能在酵母中结合GBSSⅠ和SSⅡa基因的启动子。结合这两个实验分析发现ZmbZIP104基因可能通过和GBSSⅠ基因启动子上的元件结合来调控GBSSⅠ的表达,ZmbZIP104基因对于Sh2、SSⅢa以及SBEⅡb的调控可能是通过与其他转录因子的相互作用间接调控其表达。
研究发现植物中bZIP家族转录因子参与种子成熟、种子发芽、花的发育、植物衰老、植物抗逆和光信号等多种生物学过程。目前,关于ABA介导的信号传导途径方面的研究已成为热点。ABA在植物种子的发育以及灌浆过程中起着重要的调控作用。但是ABA作为信号分子调控玉米淀粉合成基因的表达的研究较少。课题组前期的研究表明,ABA能调控玉米淀粉生物合成相关基因的表达,但调控的机制尚不清楚。
前期研究中,对玉米自交系B73授粉后10d的胚乳进行ABA处理,利用RNA-Seq高通量测序技术对处理后的玉米胚乳转录组进行测序。通过对转录组数据的分析,发现了23个有显著性差异表达的bZIP家族转录因子,同时通过生物信息学对显著性差异表达的基因做预测,初步筛选了8个转录因子作为候选基因,本研究主要是对候选转录因子ZmbZIP104进行重点分析,采用亚细胞定位(基因枪轰击洋葱表皮细胞和玉米叶片原生质体)、RT-PCR、半定量PCR、玉米胚乳瞬时过表达、酵母激活、酵母单杂交以及原核表达等实验,研究分析ZmbZIP04基因的表达模式,自身特性,与玉米淀粉合成关键酶基因启动子之间的相互作用模式,初步探究该基因的功能。具体结果如下:
1.用玉米自交系B73授粉后10d左右的胚乳cDNA为模板,从中克隆得到ZmbZIP104基因,对其蛋白序列进行生物信息学分析。结果发现ZmbZIP104基因cds序列为996bp,含有331个氨基酸,编码34.9358kD蛋白质,而且具有典型的bZIP蛋白结构域,是一个bZIP家族的转录因子;
2.对ZmbZIP104基因的表达模式进行了分析。半定量PCR结果显示ZmbZIP104基因在玉米胚乳中表达较高;实时荧光定量RT-PCR表明ZmbZIP104基因在籽粒发育的整个时期均有表达且在种子授粉后12d表达量最高。同时通过实时荧光定量RT-PCR分析了ABA对ZmbZIP104基因表达的影响,其结果与测序分析结果一致,ABA抑制ZmbZIP104基因的表达。进一步实验,对授粉后10d的胚乳进行ABA时间梯度的处理,结果表明ABA处理时间为3h时,ZmbZIP104基因表达量最低;对授粉后10d的胚乳进行ABA浓度梯度的处理,结果表明ABA处理浓度为25μM时,ZmbZIP104基因表达量最低。
3.基因枪轰击洋葱表皮细胞和玉米叶片原生质体分析ZmbZIP104基因编码蛋白的亚细胞定位,结果表明ZmbZIP104基因编码的蛋白质只定位于细胞核,说明ZmbZIP104在植物细胞核内参与转录调控的生理过程;通过酵母激活实验来分析ZmbZIP104的转录活性,结果表明ZmbZIP104基因编码的蛋白不具有转录激活活性。
4.通过玉米胚乳瞬时过表达和酵母单杂交实验研究转录因子ZmbZIP104与淀粉合成关键酶基因启动子之间的相互作用。玉米胚乳瞬时过表达结果表明转录因子ZmbZIP104基因能抑制Sh2基因启动子活性,促进GBSSⅠ、SSⅢa以及SBEⅡb基因启动子活性;酵母单杂交结果表明ZmbZIP104基因能在酵母中结合GBSSⅠ和SSⅡa基因的启动子。结合这两个实验分析发现ZmbZIP104基因可能通过和GBSSⅠ基因启动子上的元件结合来调控GBSSⅠ的表达,ZmbZIP104基因对于Sh2、SSⅢa以及SBEⅡb的调控可能是通过与其他转录因子的相互作用间接调控其表达。