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豆浆中有4种蛋白类抗营养因子:尿素酶、大豆凝集素、Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTI)、Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂(BBI)。其中,尿素酶、凝集素和KTI容易发生热失活,而BBI热稳定性极高。这与BBI含有的7个链内二硫键(SS)密切相关。鉴于豆浆体系复杂,本研究将首先从豆浆中分离BBI,考察其热失活规律;再渐次模拟豆浆体系来考察BBI热失活规律。首先根据蛋白质-多糖复凝聚理论探讨了分离BBI的提取条件。结果显示:当蛋白质与多糖质量比为5:1,pH 3.85时,可得到BBI浓缩物;而当质量比为4:1,pH 3.75时,则可得到高纯度BBI-A(>96%)。二维电泳、质谱和高效液相的结果表明:BBI浓缩物的纯度超过70%,包括BBI-A(38.8%)、BBI-D(21.9%)和BBI-C(11.1%)三种亚型。使用BBI浓缩物和BBI-A进行热处理(60~100°C)实验,考察非BBI蛋白以及BBI组成和纯度对BBI活性影响。结果表明:BBI的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性(CIA)下降速率快于胰蛋白酶抑制剂活性(TIA);BBI结构随热处理时间增加而逐渐被破坏;BBI的SS(热断裂)和一些氨基酸(如Ser和Lys)含量逐渐降低;BBI不倾向与其周围的BBI形成聚集体,而与非BBI蛋白质形成聚集体。基于前人研究,再结合本实验结果,可以确定,热处理过程中BBI分子内的β-消去反应(β-elimination reaction)及其后续反应会形成新的分子内交联,最终导致BBI空间构象改变,使其活性降低。根据第二部分结果,SS断裂是导致BBI空间结构和活性改变的重要原因。因此,本部分用二硫苏糖醇(DTT)得到不同还原程度(9.15%、23.43%、40.02%、62.09%、88.75%、99.01%)的BBI-A,以此系统考察SS对于BBI-A活性和结构的影响规律。结果表明:DTT还原BBI-A的SS可分为先快后慢两阶段,这正对应于BBI-A的5个分子表面SS和2个分子内部SS。TIA和CIA下降分为三个阶段:1个SS被还原后,TIA和CIA都下降至60%;5个SS被还原后,CIA和TIA分别下降至8%和26%;7个SS全部还原后,CIA和TIA分别剩下约2%和24%。SS还原只对BBI-A的二级结构产生轻微影响;而三级结构在5个SS被还原后发生了极大的改变,剩余2个SS被还原后,三级结构继续发生一定程度的改变。电泳和高效液相的结果也显示类似的结果。由以上结果可推断:7个SS被全部还原后,BBI-A发生重新折叠,其中BBI-A分子表面的两个疏水区域形成疏水核心。豆浆体系中含有还原糖(葡萄糖和果糖),因此本部分考察添加还原糖对于BBI热失活的影响。结果表明:还原糖对TIA下降有着明显的促进作用,而对CIA的下降则作用不明显。BBI-A的胰蛋白酶抑制剂活性位点和胰凝乳蛋白酶抑制活性位点分别为Lys 16-Ser 17和Leu 43-Ser 44。由此结构,美拉德反应可发生于Lys 16,而不能发生在Leu 43-Ser 44。另外,当BBI与葡萄糖混合后(未加热),样品的TIA和CIA呈现出增加的趋势,目前原因不明,需后续研究。最后,考察添加大豆蛋白(SP)对BBI热失活的影响。结果表明:SP可以加速BBI失活。热处理1 h,SP对TIA影响明显,1 h后影响逐渐减弱。SP也可加快CIA热失活,且影响程度随时间增加而逐渐增加。SP浓度增加不能有效地促进BBI失活。结合电泳结果,BBI与SP的热聚集反应(少量的SH/SS交换反应)是BBI热失活速度加快的主要原因。文详细阐述了BBI的热失活机理,以热处理3 h样品为例:(1)BBI浓缩物和还原糖混合模型体系,BBI的TIA降低了45%,β-消去反应及其后续反应贡献了23%,还原糖贡献了22%;BBI的CIA降低了31%,β-消去反应及其后续反应贡献了30%,还原糖贡献了1%。(2)BBI浓缩物和SP混合模型体系,BBI的TIA降低了29%,β-消去反应及其后续反应贡献了23%,SP贡献了6%;BBI的CIA降低了49%,β-消去反应及其后续反应贡献了30%,还原糖贡献了19%。