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目的:Exosomes(外来体)是一种可由多种类型细胞产生分泌的小囊泡,可由树突状细胞(DC),B淋巴细胞,T淋巴细胞及肿瘤细胞等以胞吐的方式将其排到细胞外环境。肿瘤细胞源的exosomes带有特殊的蛋白成分,在机体的免疫应答,免疫调节以及肿瘤免疫治疗方面均有重要作用,已成为一种新的亚细胞肿瘤疫苗。肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,对化疗和放疗均不敏感,易早期转移和术后复发。肿瘤免疫治疗是近年来出现的颇有希望的预防和治疗候选方案之一。本研究将小鼠肝癌细胞(H22)源的exosomes进行分离提取并分析其相关蛋白组分,在荷瘤动物模型观察该exosomes激发宿主抗肝癌免疫应答的效应及其免疫机制,为exosomes作为肿瘤疫苗预防肝癌复发和转移提供实验依据,为exosomes的进一步研究提供一定的理论基础。方法:1小鼠肝癌细胞(H22)来源的exosomes制备及其免疫相关蛋白的分析:采用超速分级离心和蔗糖密度梯度离心提取纯化exosomes;经透射电镜观察鉴定其形态大小;运用肽质量指纹谱质谱分析和免疫印迹法(Western blot)检测exosomes含有的蛋白成分。2小鼠肝癌细胞(H22)来源的exosomes激发宿主抗肿瘤作用的研究:H22肿瘤细胞来源的exosomes在雌性小鼠皮下接种免疫3次,同时设PBS组为对照。免疫结束后一周,在小鼠右腋皮下接种亲本细胞H22细胞,5×l05个/只,观察各组肿瘤生长情况;用MTT法检测小鼠脾细胞增殖情况和细胞毒活性;用免疫组织化学法检测肿瘤组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润情况。结果:1小鼠肝癌细胞(H22)来源的exosomes制备及其免疫相关蛋白的分析:从小鼠肝癌细胞H22培养上清液中提取出exosomes,电镜观察有多个大小不一,呈圆形或椭圆形的膜性囊泡,直径约为20～90nm,中央可见为低密度光亮区.有时聚集成群。经肽质量指纹谱质谱分析和Western blot检测到该exosomes含有HSP70、ICAM-1、EF-G2、动力蛋白轻链A、C-myc和Vav-2蛋白。Western blot分析exosome和H22细胞裂解物一样均含有HSP70、ICAM-1和C-myc,且exosome中的HSP70和ICAM-1含量比H22细胞裂解物的多。2小鼠肝癌细胞(H22)来源的exosomes激发宿主抗肿瘤作用的研究:2.1各组小鼠分别经H22肿瘤细胞来源exosomes和PBS皮下注射3次,免疫结束后一周,在小鼠右腋皮下接种肿瘤细胞H22, PBS对照组于肿瘤接种后的第6天可观察到肿瘤的生长,而exosomes组于第16天才观察到肿瘤的生长,80天的观察周期内,PBS组小鼠于第22天全部死亡, exosomes组小鼠存活率为33%(3/9),其中22%(2/9)的小鼠保持无瘤状态。PBS组、exosomes组在第22天肿瘤平均体积分别为13.5467cm2、3.3037cm2。exosomes组肿瘤出现时间延迟,肿瘤生长缓慢,小鼠生存期延长。2.2小鼠脾淋巴细胞增殖的检测,显示exosomes实验组中脾细胞的增长多于未加刺激物的对照组;与对照组相比,exosomes对免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖有较强的刺激作用;经exosomes免疫后,脾细胞对ConA反应性与正常对照组相比也显著增高。2.3小鼠脾细胞细胞毒活性随效靶比的上升而逐渐提高,Exosomes免疫组在效靶比为12.5∶1、25∶1、50∶1、100∶1时肿瘤细胞杀伤率分别高于PBS组,效靶比为100∶1时exosomes免疫组和PBS组的肿瘤细胞杀伤率分别为:63.83%、16.09%。2.4两组肿瘤组织切片标本经免疫组织化学染色法检测, Exosomes组肿瘤组织中有较多CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润,与PBS组相比,有显著性差异(P<0.05)。提示exosomes可以诱导T细胞活化,促进宿主的抗肿瘤细胞免疫应答。结论:1超速分级离心和蔗糖密度梯度离心法成功地提取和纯化了小鼠肝癌细胞(H22)源的exosomes,该实验方法具有可行性,经电镜观察到该exosomes的形态为:呈圆形或椭圆形,直径约为20～90nm,多个,外包裹着被膜的囊泡。为今后的exosomes研究工作提供了实验基础。2肽质量指纹谱质谱分析和Western blot检测出,小鼠肝癌细胞H22源exosomes表达有与抗原呈递相关蛋白(HSP70、ICAM-1),粘附相关蛋白(ICAM-1)和肿瘤相关蛋白(C-myc蛋白、Vav-2蛋白),说明其具有免疫原性,还表达有迁移相关蛋白(动力蛋白轻链A),细胞骨架相关蛋白(EF-G2)。且exosomes表达的抗原呈递相关蛋白(HSP70、ICAM-1)的含量高于H22细胞裂解物,提示exosomes更能将肿瘤抗原呈递给抗原呈递细胞(APC)而诱发免疫应答。3小鼠肝癌细胞H22源exosomes可诱导小鼠抗肝癌作用,抑制肿瘤生长;且对亲本细胞荷瘤小鼠有一定免疫保护作用:肿瘤出现时间延迟,肿瘤生长缓慢,小鼠生存率提高。4肿瘤源exosomes能激活脾淋巴细胞,促进其生长与增殖,从而有效地激活免疫系统;能增强小鼠脾淋巴细胞细胞毒活性,有效地诱导特异性的杀伤肿瘤细胞活性;可促进CD4+和CD8+T细胞活化,诱导局部和系统的抗肿瘤免疫,引发特异性的免疫应答。可见肿瘤源exosomes作为一种新型的肿瘤疫苗可能有广阔的临床应用前景。