研究目的与意义：糖尿病肾病是糖尿病微血管病变之一,也是导致终末期肾病最重要的原因。血流动力学改变、异常的糖脂代谢、氧化应激、炎症反应等机制均在糖尿病肾病的发病过程中发挥重要作用。近年的研究表明蛋白乙酰化表观修饰参与到上述各种发病机制并发挥越来越重要的作用,并有可能成为治疗肾脏疾病的药物靶点。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)与组蛋白乙酰化酶(HAT)在体内共同作用,完成对蛋白组乙酰化水平的调控。目前人体内共有18种HDAC亚型,根据基因的同源性共分为4大类,Ⅰ类HDAC包括HDAC1、2、3、8；Ⅱ类HDAC又分为Ⅱa和Ⅱb两大类,Ⅱa类包括HDAC4、5、7、9, Ⅱb类HDAC包括HDAC6、10;Ⅲ类HDAC包括SIRT1-7; Ⅳ类HDAC只有HDAC11.其中Ⅰ Ⅱ Ⅳ类HDAC的酶活性是Zn2+依赖型而Ⅲ类HDAC酶活性属于NAD+依赖型。Ⅰ类HDAC主要分布在细胞核内,而Ⅱ类HDAC则在不同机制的调控下存在核质穿梭过程。不同亚型HDAC的功能具有很大差异,因此明确各亚型HDAC在肾脏疾病中的作用机制具有非常重要的意义。作为抗肿瘤药物成功上市的HDAC印制剂极大的推动了乙酰化修饰的研究范围。多项研究表明,HDAC抑制剂可以通过抗炎和抗纤维化等机制发挥对糖尿病肾病的保护作用,其中涉及到对EGF-EGFR信号通路及eNOS信号通路的调控。目前的研究均使用HDAC非特异性抑制剂,HDAC各亚型在肾脏疾病的发病过程发挥的功能尚不清楚,虽有研究发现HDAC2在STZ诱导的糖尿病肾病大鼠及db/db小鼠中活性增强,并且HDAC2在TGF-β1刺激下活性增高,促进了肾小管EMT过程的发生,但是目前各亚型HDAC在肾小球细胞中的表达以及功能仍未见报道,因此HDAC在肾小球细胞中的作用机制是研究重点。小分子HDAC抑制剂主要作用于Zn2+依赖型HDAC,因此阐明Zn2+依赖型HDAC在糖尿病肾病中的作用机制对HDAC抑制剂应用于肾脏疾病治疗有着重大意义。足细胞损伤发生在糖尿病肾病的起始阶段,足细胞从基底膜脱落导致细胞数量的减少,进而引起蛋白尿的产生。多种信号通路参与糖尿病引起的足细胞损伤过程,目前越来越多的研究表明自噬活性的改变是导致肾脏疾病以及足细胞损伤的重要原因之一,但糖尿病肾病条件下自噬的调控机制尚未明确。最近的一项研究显示,STAT1在糖尿病肾病的发病过程中发挥着自噬抑制作用。STAT1具有乙酰化修饰位点,但在糖尿病肾病条件下HDAC是否对STAT1进行乙酰化水平修饰进而影响STAT1的功能迄今未见报道,因此研究STAT1乙酰化水平的修饰对于阐明糖尿病肾病发病过程中自噬水平的调控具有重要意义。研究方法：1.动物学研究：1.1 STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏皮质组织中HDAC各亚型的表达检测：选取30SD大鼠,雄性,体重200-250g,随机分成两组,即正常对照组和STZ诱导糖尿病肾病组。通过测定大鼠空腹血糖及24h尿量、尿蛋白水平确定糖尿病肾病模型构建成功。分别采用Real-time RT-PCR、蛋白免疫印迹法(Western Blot, WB)和免疫组织化学法(Immunohistochemistry, IHC),检测HDAC各个亚型在糖尿病肾病大鼠肾脏皮质组织中表达的变化。1.2 Ⅱ型糖尿病肾病db/db小鼠肾皮质组织中HDAC2. HDAC4及HDAC5表达检测：WB方法检测db/+组小鼠与db/db组小鼠肾皮质组织中HDAC2.HDAC4及HDAC5表达的变化。2.糖尿病肾病肾活检样本研究：从山东大学病理学教研室获得正常人、糖尿病肾病病人、糖尿病非肾病病人、局灶性节段性肾小球硬化病人活检样本。IHC检测糖尿病肾病病人肾活检样本中HDAC2、HDAC4及HDAC5蛋白水平；Real-time RT-PCR检测肾活检标本中HDAC2.HDAC4及HDAC5 mRNA水平,统计HDAC2、HDAC4及HDAC5 mRNA水平与估算肾小球滤过率(eGFR)的相关性；检测HDAC4 mRNA水平在FSGS标本中的表达；检测自噬相关蛋白LC3、Beclin、 ATG5、ATG7 mRNA水平。3.体外实验研究：3.1 HDAC2、HDAC4及HDAC5在肾脏固有细胞中的表达：体外培养肾脏固有细胞,包括系膜细胞、足细胞、肾小球内皮细胞以及肾小管上皮细胞；体外模拟糖尿病肾病病理状态,WB检测肾脏固有细胞中HDAC2、HDAC4及HDAC5在高糖(HG)、糖基化终末产物(AGE)、和转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激下的表达。3.2 HDAC4表达的干预以及对足细胞功能的影响：转染shRNA-HDAC4质粒基因沉默足细胞中的HDAC4并转染足细胞pCMV6-HDAC4质粒过表达HDAC4蛋白；ELISA检测HG刺激以及HDAC4基因沉默对足细胞致炎因子和生长因子水平的影响；采用流式细胞仪检测HG以及HDAC4基因沉默对足细胞凋亡的影响。3.3 HDAC4对足细胞自噬水平的调控：WB检测HG,HDAC基因沉默及HDAC4基因过表达对足细胞自噬相关蛋白表达的影响；使用电镜观察HDAC4基因沉默对足细胞自噬的影响；使用腺病毒为载体的GFP-RFP-LC3质粒转染足细胞,检测HDAC4基因沉默对足细胞自噬流的影响。3.4 HDAC4基因沉默介导的自噬激活对足细胞功能的影响：WB检测HDAC4基因沉默以及Rapamycin干预对足细胞nephrin、 podocin表达的影响；流式细胞仪检测HDAC4基因沉默以及Rapamycin干预对足细胞凋亡的影响；通过免疫荧光对足细胞微丝蛋白F-actin染色并应用激光共聚焦观察,检测HDAC4基因沉默以及Rapamycin干预对足细胞骨架结构的影响。3.5 HDAC4对STAT1去乙酰化作用的检测：Co-IP检测HDAC4与STAT1的相互作用；Co-IP检测HDAC4基因沉默与过表达对STAT1乙酰化水平的影响；应用免疫荧光以及激光共聚焦观察HDAC4对STAT1定位的调控。4.慢病毒转染介导的HDAC4基因沉默对肾脏功能的影响：构建慢病毒载体的shRNA-HDAC4质粒,采用肾脏实质注射法转染肾脏组织,每个肾脏有效注射量约为100μl,107TU,一周后糖尿病肾病大鼠尾静脉注射STZ (50mg/kg,溶于pH4.45柠檬酸缓冲液),正常对照组同时给予相应体积柠檬酸缓冲液。荧光显微镜观察肾脏冰冻切片中GFP荧光强度,检测慢病毒载体shRNA转染效率；WB以及Real-time RT-PCR检测HDAC4蛋白与mRNA的沉默效率；形态学方法检测HDAC4基因沉默对糖尿病肾病损伤的影响；ELISA检测HDAC4基因沉默对足细胞致炎因子和生长因子水平的影响；WB检测HDAC4基因沉默对肾脏自噬相关蛋白以及nephrin表达的影响。结果1动物模型中Zn2+依赖型HDAC各亚型的表达：1.1 STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏组织中HDAC表达的变化Real-time RT-PCR及WB检测Zn2+依赖型HDAC各亚型的表达,结果显示,糖尿病肾病模型组HDAC2、HDAC4及HDAC5的mRNA与蛋白水平显著上调,而HDAC1、3、 6、7、 8、9、10及11的mRNA与蛋白表达水平并没有显著性差别,相一致,模型组肾脏组织石蜡切片中HDAC2、HDAC4及HDAC5的表达显著性上调。1.2 Ⅱ型糖尿病肾病db/db小鼠肾皮质组织中HDAC2、HDAC4及HDAC5表达的变化WB检测发现,与db/+组小鼠相比,db/db组小鼠中肾皮质组织中HDAC2、 HDAC4及HDAC5的蛋白水平显著上调。2.糖尿病肾病及FSGS患者肾活检标本中HDAC2、HDAC4及HDAC5表达的变化IHC结果发现糖尿病肾病患者肾活检标本中HDAC2、HDAC4及HDAC5的蛋白表达显著升高；糖尿病肾病肾活检标本中HDAC4和HDAC5的mRNA水平显著升高,HDAC2的mRNA水平有升高趋势但没有统计学意义；相关性分析发现,HDAC2、HDAC4及HDAC5的mRNA水平与eGFR值成负相关；FSGS’肾活检标本中HDAC4 mRNA水平显著升高。3.体外研究HDAC4在糖尿病肾病足细胞损伤过程中的功能及作用机制：3.1损伤因子诱导足细胞中HDAC4表达的变化足细胞中HDAC4在HG.AGE和TGF-β1的刺激下表达显著上调并呈浓度依赖性。应用synpatopodin抗体标记足细胞,检测糖尿病肾病模型组足细胞中HDAC4的表达,与体外的结果一致,HDAC4在模型组足细胞中表达特异性上调。WB检测发现,在高糖和AGE的刺激下系膜细胞中HDAC5表达显著升高。在TGF-β1的刺激下,肾小球内皮中HDAC5的表达有下调趋势。在HG培养条件下,肾小管内皮细胞中HDAC2在HG的刺激下表达显著升高。3.2 HDAC4基因沉默能够减少高糖引起的足细胞炎症反应及足细胞的凋亡Real-time RT-PCR检测致炎因子和生长因子的水平,结果显示,基因沉默HDAC4可以缓解高糖引起的炎症反应。流式细胞技术检测发现HDAC4的基因沉默可以减少高糖引起的足细胞凋亡,同时过表达HDAC4的质粒能够促进足细胞的凋亡。3.3 HDAC4促进HG引起的足细胞自噬功能障碍WB检测LC3B及Beclinl的表达,结果显示,HG能够降低LC3BII/LC3BI值及LC3B和Beclinl的表达,HDAC4基因沉默能够显著增强自噬相关蛋白的表达,HDAC4过表达能够进一步降低自噬相关蛋白的表达；电镜观察显示HDAC4基因沉默能够增加足细胞中自噬小体的个数；转染足细胞腺病毒载体GFP-RFP-LC3质粒,标记足细胞内自噬小体以及自噬流的变化,通过激光共聚焦观察显示HDAC4基因沉默不仅能够增加自噬小体的数量,还能够增加自噬溶酶体的形成。3.4抑制足细胞自噬会破坏足细胞骨架结构的完整性HG培养导致足细胞裂孔膜蛋白nephrin和podocin表达降低,HDAC基因沉默及Rapamycin干预都能够增加nephrin、podocin的表达。进一步对足细胞微丝蛋白F-actin染色并应用激光共聚焦观察,结果显示,HG导致足细胞F-actin微丝断裂且排列不规则,在细胞内成聚集状态,HDAC4基因沉默以及Rapamycin干预能够缓解HG培养对F-actin微丝结构的破坏。3.5 HDAC4介导的STAT1的去乙酰化作用促进了STAT1的质核转移及活化Co-IP检测HDAC4与STAT1的相互作用,结果显示,HG虽不能增加STAT1的表达,但增加了HDAC4与STAT1的结合量；Co-IP检测HDAC4对STAT1的乙酰化水平的影响,结果显示,HG能够降低STAT1的乙酰化水平,而HDAC4基因沉默能够增加STAT1的乙酰化水平,HDAC4过表达则导致STAT1乙酰化水平进一步降低；通过免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜观察显示HG能够促进STAT1质核转移,而HDAC4基因沉默能够阻断这一过程。4. HDAC4基因沉默能够改善STZ诱导的糖尿病肾损伤4.1慢病毒转染肾脏效率应用荧光显微镜观察病毒转染后肾脏冰冻切片,可以观察到肾脏组织中具有显著的荧光转染效率。慢病毒载体shRNA-HDAC4质粒转染一周内能够显著降低HDAC4的mRNA水平,并且转染12周后HDAC4 mRNA水平仍显著低于正常值。GFP与synaptopodin的共定位实验显示GFP能够在足细胞中表达。4.2慢病毒转染介导的HDAC4基因沉默对于STZ诱导的糖尿病肾病损伤以及足细胞的损伤具有保护作用PAS染色以及电镜观察,结果显示,慢病毒转染介导的HDAC4基因沉默明显缓解糖尿病肾病以及足细胞的损伤,并能显著降低肾脏炎性因子水平。4.3慢病毒转染介导的HDAC4基因沉默增加自噬相关蛋白的表达WB结果表明示糖尿病肾病大鼠肾脏皮质组织中LC3BⅡ/LC3BⅠ的值以及LC3BⅡ Beclin1的表达显著降低,而慢病毒转染介导的HDAC4基因沉默能够明显增加糖尿病肾病大鼠肾脏皮质组织中LC3BⅡ/LC3BⅠ的值以及LC3BⅡ, Beclin1的表达。4.4慢病毒转染介导的HDAC4基因沉默显著增加裂孔膜蛋白nephrin的表达WB结果显示,糖尿病肾病大鼠肾脏皮质组织中nephrin的表达显著降低,而慢病毒转染介导的HDAC4基因沉默能够增加糖尿病肾病大鼠肾脏皮质组织中nephrin的表达。结论与创新性：1.首次明确了参与糖尿病肾病病理生理过程的Zn2+依赖型HDAC的亚型,并进一步发现HDAC4在促进足细胞炎性反应与细胞稳态调控中发挥关键作用,为深入研究乙酰化修饰在糖尿病肾病中的作用机制,筛选特定HDAC作为糖尿病肾病早期诊断的标志物,寻找新的治疗靶标,指导设计和开发针对HDAC亚型的抑制剂并更好地应用于糖尿病肾病的防治提供重要的实验基础和理论依据。2. HDAC4通过降低与机体的炎症过程及自噬调控密切相关的信号转导子和转录激活子(STAT1)的乙酰化水平,引起STAT1的磷酸化并转位到细胞核内而活化,从而激活相应炎性基因的转录与表达,促进足细胞的炎性反应,导致足细胞自噬功能的障碍。