生姜根腐病的病原菌分离鉴定及其生物防治

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生姜根腐病是生姜生产过程中危害性较大的一种土传病害,主要由腐霉菌、镰刀菌和细菌引起,发病严重的地区可减产50%-80%,甚至绝产。在大多数情况下,生姜根腐病发生在天气条件有利于病原菌生长的条件。目前防治生姜根腐病的措施主要是.化学防治,但过多使用化学农药严重影响到人类健康并造成环境污染,且会导致病原菌菌株耐药等问题。因此,寻找广谱、高效、低毒的生物农药已成为科研人员及农药使用人员的共识。2018年夏季潍坊地区出现强降水,导致大部分生姜种植地块被淹没,雨后气温转高。因此降水过后生姜根腐病大面积地爆发,大多数生姜种植区土地被感染,农民损失惨重。为了明确该地区生姜根腐病的病原菌种类,并进一步利用微生物资源对其进行防治,于2018年9月前往潍坊,采集病姜样本,进行生姜根腐病病原菌分离鉴定;并研究了微生物源抗菌脂肽对病原菌的抑菌作用;另外通过筛选获得了一株病原菌拮抗的芽孢杆菌,确定了其拮抗效果;最后优化了拮抗菌产芽孢培养基并确定了培养条件参数,以期实现生姜根腐病防治工作上的应用。1.通过组织分离法从发病生姜中分离出生姜根腐病病原菌,将其回接到健康的生姜中,生姜出现与根腐病相同的症状,经人工接种的病姜中再次分离到了该真菌,满足科赫法则确定病原菌的条件;利用形态鉴定及分子生物学鉴定确定生姜根腐病病原菌为群结腐霉。2.五种微生物源抗菌脂肽(bacillomycin D、iturin A、fengycin、brevibacillin、brevibacillinV)对群结腐霉皆有抑菌效果,其中抑菌效果最好的为侧孢短芽孢杆菌所产的brevibacillin,测定其对群结腐霉的EC50为13.081 μg/mL;通过碘化丙啶染色和吸光值测定发现brevibacillin改变了群结腐霉细胞膜通透性,使其内容物泄露,导致群结腐霉的生长发育延迟;通过扫描电镜观察发现其造成了群结腐霉菌丝表面形态发生褶皱。生姜切片侵染结果显示,浓度为26 μg/mL、52 μg/mL的brevibacillin处理组较阴性对照组的发病率分别降低了 40%、57.7%;感染指数较阴性对照组分别降低了41 和 58.9。3.筛选到一株生姜根腐病病原菌拮抗芽孢杆菌B3,通过形态观察、分子生物学鉴定和生理生化鉴定,将其鉴定为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)。共培养试验表明,副地衣芽孢杆菌B3初始浓度为104 CFU/mL时群结腐霉的菌丝生长量仅为对照组的9.2%;而在群结腐霉在培养基中预先培养48h的情况下,接入105 CFU/mL的副地衣芽孢杆菌就能显著抑制群结腐霉菌丝生长,当接入副地衣芽孢杆菌的浓度为106CFU/mL、107 CFU/mL时,群结腐霉的生长量较对照组降低了 88.5%和93.1%;副地衣芽孢杆菌B3处理能够改变群结腐霉菌丝形态使菌丝生长弯曲,萎缩变形,粗细不均。4.优化了拮抗菌副地衣芽孢杆菌B3的产芽孢培养基,最佳产孢培养基配方为:麦麸10 g,酵母膏14 g,氯化钙2.5 g,硫酸锰0.15 g,水1 L;确定了最佳培养条件参数:最佳pH为5.5,最佳装液量为30 mL/250mL锥形瓶,最佳发酵时间为72 h,最佳发酵温度为40℃;通过培养基及发酵条件优化,副地衣芽孢杆菌B3的芽孢数由4.6×106CFU/mL提高到9.55×109CFU/mL。生姜切片试验结果表明拮抗菌副地衣芽孢杆菌B3能够明显降低生姜根腐病的发病率:接种浓度为107 CFU/mL、108 CFU/mL副地衣芽孢杆菌菌体处理组的发病率分别为为56.7%和46.7%,较阴性对照组的发病率分别降低了 43.3%、53.3%;拮抗菌处理组的感染指数分别为30和26,较阴性对照组分别降低了 67.7和71.7。
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