论文部分内容阅读
目的: 本论文重点研究负载中药淫羊藿苷生物陶瓷材料对骨缺损的修复作用,探讨淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的生物学作用及相关机理。构建负载淫羊藿苷的微纳米修饰羟基磷灰石(micro-nano hybrid structured Hydroxyapatite,micro-nano HAp)控释给药系统,应用于大鼠股骨缺损,以评价其体内成骨成血管修复效果;进一步在大鼠骨质疏松模型上,研究探讨全身给药及局部载淫羊藿苷磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)控释系统对骨质疏松大鼠颅骨缺损的修复效果,为骨缺损再生修复提供新的思路和方法。 材料与方法: 1、对年轻大鼠BMSCs,给予不同浓度的淫羊藿苷处理,通过MTT法、流式细胞周期、细胞凋亡、Real-time PCR、western blotting、碱性磷酸酶活性检测及酶联免疫吸附测定等检测淫羊藿苷对BMSCs增殖、成骨分化及成血管因子表达的影响,并进一步通过western blotting法和抑制试验探讨ERK、p38和JNK等分子信号通路在其中的作用。 2、构建年轻大鼠股骨缺损模型,将淫羊藿苷负载于micro-nano HAp后植入大鼠股骨缺损处,通过Micro-CT、序列荧光标记和组织学检测新骨形成情况,通过Microfil和Micro-CT观察其血管生成情况。 3、通过卵巢去除法(ovariectomy,OVX)建立大鼠骨质疏松动物模型;对骨质疏松BMSCs(BMSCs(OVX))给予不同浓度的淫羊藿苷处理,观察淫羊藿苷对BMSCs(OVX)增殖、成骨分化、成血管因子表达的影响;同时观察不同浓度下破骨细胞的生成情况。 4、构建骨质疏松大鼠颅骨缺损模型,淫羊藿苷负载于CPC后将BMSCs(OVX)负载于复合材料上,植入大鼠颅骨缺损处,术后给予骨质疏松大鼠淫羊藿苷灌胃处理,通过Micro-CT、序列荧光标记和组织学检测不同组别骨质疏松大鼠颅骨缺损的再生修复效果,并观察其血管生成情况。 结果: 1、不同浓度的淫羊藿苷对BMSCs的增殖有抑制作用,且淫羊藿苷的增殖抑制作用呈浓度依赖性。 2、淫羊藿苷可促进BMSCs的成骨、成血管基因表达及ALP活性,以20μM浓度效果最佳。 3、淫羊藿苷作用于BMSCs,ERK、p38和JNK磷酸化增强,且ERK、p38和JNK通路被阻断后淫羊藿苷诱导的BMSCs成骨分化也受到抑制,而在ERK被阻断后淫羊藿苷诱导的BMSCs成血管因子表达受到抑制。 4、Micro-nano HAp可缓慢地释放淫羊藿苷;大鼠股骨缺损部位填充载淫羊藿苷micro-nano HAp后其新骨及血管生成量增多。 5、BMSCs(OVX)在淫羊藿苷作用下细胞增殖无明显变化,但其成骨、成血管基因表达及ALP活性表达增强,以20μM浓度最为明显。 6、CPC可缓慢释放淫羊藿苷;在骨质疏松大鼠颅骨缺损模型中,淫羊藿苷局部缓释组的新骨形成及血管生成均较空白对照组强,联合淫羊藿苷全身给药后,其骨修复效果最为显著。 结论: 1、淫羊藿苷对大鼠BMSCs的增殖有抑制作用,但对其成骨分化和成血管因子的表达有明显促进作用,以20μM浓度最为明显。 2、ERK参与淫羊藿苷诱导BMSCs成骨分化和成血管因子表达的过程,而p38和JNK信号途径可能仅参与淫羊藿苷诱导的成骨过程。 3、Micro-nano HAp可作为淫羊藿苷的缓释载体;淫羊藿苷micro-nano HAp缓释系统有利于促进骨缺损的修复。 4、淫羊藿苷对BMSCs(OVX)的增殖无明显促进或抑制作用,但可促进BMSCs(OVX)成骨分化和成血管因子表达,以20μM浓度最为明显。 5、CPC可作为淫羊藿苷的缓释载体;淫羊藿苷全身给药联合局部缓释用药促进骨修复能力最显著。