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副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae,Vc)均属于革兰氏阴性菌,是引起食源性胃肠炎或败血症的重要病原体。它们广泛分布于河口、沿海水域及沉积物,随着海产品消售量日益增加,建立一种能同时检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的快速准确的检测方法至关重要。致病性副溶血弧菌公认的毒力因子为耐热稳定性直接溶血素(TDH)与TDH相关溶血素(TRH)。近几年发现的VⅥ型分泌系统(T6SS)广泛存在于革兰氏阴性细菌中,在细菌的生存及致病性上起着非常重要的作用。由T6SS递送的多种蛋白质,被称为“效应因子”,现在已被鉴定并在靶细胞中呈现各种毒性活性。本研究首次建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌(toxR)和霍乱弧菌(ompW)的双重荧光定量PCR方法,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效手段。采用超滤管浓缩法、Label-free蛋白组学分析及Western-blot技术,从野生株SH112和双缺失株△vipA1-hcp1中成功筛选并鉴定分泌蛋白VP0837和VP0285均属于副溶血弧菌T6SS-1的效应因子。此外,通过对效应蛋白VP0837基因缺失株生物学特性和致病性分析,表明T6SS-1在副溶血弧菌的致病过程中扮演着重要的角色。试验Ⅰ 副溶血弧菌与霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重荧光定量PCR方法。根据副溶血弧菌toxR基因和霍乱弧菌ompW基因设计特异性引物与探针。结果表明:此方法对这两种菌的最低检测限均达到10CFU/mL,灵敏度高;特异性试验表明这两种细菌与其他病原菌(如:大肠杆菌0157、沙门氏菌、拟态弧菌、创伤弧菌)均无交叉反应;重复性实验表明变异系数均小于1.5%,说明重复性好。采用人工染菌虾肉样品并及时检测,副溶血弧菌和霍乱弧菌的最低检测限分别为100 CFU/mL和50 CFU/mL,人工染菌贝类样品的最低检测限分别为50 CFU/mL和50 CFU/mL。两种细菌在虾肉中富集2h后的最低检出限均为1 CFU/mL。结论:本研究所建立的双重荧光PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点,包括DNA提取的整个检测过程可在1～3 h内完成,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效方法。试验Ⅱ 副溶血弧菌T6SS-1效应蛋白的筛选与鉴定为初步筛选、鉴定副溶血弧菌T6SS-1效应蛋白。基于本实验室前期研究成果,采用超滤管浓缩法分别提取副溶血弧菌野生株SH112和△vipA1-hcp1双缺失株的分泌蛋白。蛋白酶解后用于LC-MS/MS检测,将所筛选的蛋白进行基因本体注释(GO)分析和LFQ(Label Free Quantitation)分析。另外,选取两种分泌蛋白VP0837和VP0285进行原核表达,制备多克隆抗体,并采用Western-blot方法对提取的分泌蛋白进行鉴定。结果显示:利用LC-MS/MS方法成功鉴定了 52个差异蛋白质,其中在△vipA1-hcp1中下调的蛋白有36个,上调的有16个;GO结果表明所鉴定的蛋白主要参与代谢作用、生物学定位、信号分子、氧化还原、生物学结合等过程。Western-blot表明,鼠抗VP0837和VP0285的血清均能特异性识别副溶血弧菌野生株SH112的上清蛋白,而未能识别双缺失株△vipA1-hcp1的上清蛋白;表明分泌蛋白VP0837和VP0285均属于副溶血弧菌T6SS-1的效应蛋白,并且对T6SS-1的分泌功能起着重要作用。本试验结果为进一步研究VP0837和VP0285蛋白功能及副溶血弧菌快速检测方法奠定了基础。试验Ⅲ 副溶血弧菌T6SS-1效应蛋白VP0837基因缺失株的构建及致病性分析本试验旨在研究T6SS-1在副溶血孤菌生物学特性和致病性中发挥的作用,以T6SS-1分泌蛋白VP0837为研究对象,构建副溶血弧菌SH112株vp0837基因缺失株和互补株。通过分析各菌株的生长特性、运动性、生物被膜形成能力的差异;比较缺失株对细胞黏附入侵与毒性、细胞炎性因子转录水平的差异以及对小鼠致死率的影响。试验结果显示:与野生株相比,缺失株△vp0837与互补株C△vp0837的生长速度和生物被膜形成能力均差异不显著;△vp0837对Caco-2细胞的毒性、黏附与入侵作用明显降低,而使Caco-2细胞炎性因子IL-1β和IL-6表达显著上调;对ICR小鼠的致死率显著下降。上述结果提示副溶血弧菌T6SS-1中分泌蛋白vp0837基因不仅参与了对宿主的细胞毒力和致炎性等致病过程,而且对鼠死亡率也发挥着明显的作用,充分说明vp0837基因在副溶血弧菌的感染致病过程中扮演重要的角色。