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目的探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)能否通过抑制CD4~+T淋巴细胞产生炎症因子来改善骨修复的微环境,进而促进人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cel s,h UC-MSCs)的骨修复。方法将健康6周龄Balb/c裸鼠72只随机分成三组分别为空白对照组、溶剂对照组、白藜芦醇组,每组24只。体外分离培养h UC-MSCs,并将第三代细胞种植于明胶海绵表面共培养3天备用。体外分离并筛选Balb/c小鼠脾脏CD4~+T淋巴细胞,将溶剂溶剂对照组和白藜芦醇组所有裸鼠经尾静脉注射CD4~+T淋巴细胞,按1×106/只,2天后对所有裸鼠的右侧颅顶骨建立4mmx4mm全层骨缺损模型同时将已培养好的以明胶海绵为支架的第三代h U-MSCs植入缺损区,造模后空白对照组和溶剂对照组均给予白藜芦醇空白溶解剂(5%的DMSO生理盐水溶液)腹腔注射0.2ml/只,每日一次。白藜芦醇组给予RES(RES用DMSO溶解,用生理盐水稀释),剂量为30mg/kg/d,按0.2ml/只腹腔注射,每日一次。术后1周、2周、3周随机抽取6只裸鼠断头取血,ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6的浓度。术后8周处死每组剩余的6只裸鼠,完整切取颅骨。采用Micro-CT及组织病理切片的方法来观察缺损部位新生骨生长情况,测量其面积大小,定量分析缺损部位的骨形成能力。通过免疫组化检测Runx2和OCN两种蛋白在缺损部位新生骨中的表达情况。结果1倒置相差显微镜下h U-MSCs的形态特征:h U-MSCs生长状态良好,呈梭形、短杆状的贴壁细胞。单个的细胞为成纤维状,细胞汇合时呈平行排列、旋祸状生长。2 h U-MSCs表面抗原表达:均一地表达CD73、CD90、CD105,不表达CD19、CD11b,不表达CD34、CD45以及MHC-II类分子HLA-DR,符合间充质干细胞的表型特征。3扫描电镜结果:有h U-MSCs粘附于明胶海绵表面或深部孔隙表面,接种干细胞并培养3天的明胶海绵支架虽略有降解但结构仍保持完好。4筛选出的T淋巴细胞流式结果:CD4~+T淋巴细胞占磁珠筛选细胞的比例为97.45%±0.05%,其中,CD4~+CD25~+细胞所占比例为8.05%±1.82%。5 ELISA结果:1周、2周、3周三个时间点,溶剂对照组IFN-γ的水平均明显高于空白对照组和白藜芦醇组,差异具有统计学意义(P<0.05);三个时间点,溶剂对照组TNF-α的水平均明显高于空白对照组和白藜芦醇组,差异具有统计学意义(P<0.05);三个时间点三组血清IL-6的水平逐渐降低,三个时间点,溶剂对照组IL-6的水平均明显高于空白对照组和白藜芦醇组,差异具有统计学意义(P<0.05)。6 Micro-CT结果:8周后三组裸鼠颅骨缺损区均未完全修复,缺损边缘不整齐,三组裸鼠颅骨缺损区都有所生长,新生骨组织由缺损边缘逐渐向缺损区内侧生长。Micro-CT检测数据结果:TV值:与溶剂对照组(40.76±0.95)比,其空白对照组(46.04±3.53)和白藜芦醇组(43.35±0.87)骨痂总体积均显著增多,其差异具有统计学意义(P<0.05)。BV值:与溶剂对照组(1.93±0.19)比,空白对照组(2.93±0.35)和白藜芦醇组(2.58±0.33)矿化骨组织体积均有所增多,其差异具有统计学意义(P<0.05)。BV/TV的比值:与溶剂对照组比(4.72±0.47),空白对照组(6.39±0.95)和白藜芦醇组(5.94±0.70)相对骨体积均显著增多,其差异具有统计学意义(P<0.05)。7 HE染色及Masson染色:HE染色结果:造模8周后,成骨前体细胞迁徙聚集于缺损边缘和硬脑膜下,进一步分化为成骨细胞同时分泌类骨质。有大量骨细胞存在于类骨质陷凹中,在骨膜下有骨膜新生骨形成。颅骨缺损中央被结缔组织填充,未见明显骨组织形成。缺损边缘新生骨质进一步增多,在缺损边缘的新生骨组织中有类似“髓腔”样结构形成,其间存在大量核被染成蓝色的间充质细胞。Masson染色显示:8周时,三组均有新骨形成,均可见蓝色的骨细胞和骨样组织以及成熟的骨性胶原纤维排列整齐而致密,有部分板层骨形成。还可见部分比较成熟的新生骨组织被染成红色。8 IHC染色:RUNX2结果:溶剂对照组裸鼠新生骨组织中可见少量RUNX2的阳性表达细胞。同溶剂对照组相比,空白对照组RUNX2染色的阳性细胞数显著增加,IOD值均明显增加(P<0.05)。与溶剂对照组相比,白藜芦醇组RUNX2的阳性表达细胞显著增多,IOD值明显增加(P<0.05)。OCN结果:溶剂对照组裸鼠新生骨组织中可见OCN的阳性表达细胞数量较少。同溶剂对照组相比,空白对照组OCN染色的阳性细胞数显著增加,IOD值均显著增加(P<0.05)。与溶剂对照组相比,白藜芦醇组OCN的阳性表达细胞数量显著增多,IOD值明显增加(P<0.05)。结论白藜芦醇(RES)能通过抑制CD4~+T淋巴细胞分泌炎性细胞因子来改善骨修复微环境,从而促进h UC-MSCs骨修复。