【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）作为危害全球养猪业的一种高度接触性传染病,给我国养猪业带来了严重的经济损失。该病主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起。GP5蛋白及M蛋白作为PRRSV的主要结构蛋白
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）作为危害全球养猪业的一种高度接触性传染病,给我国养猪业带来了严重的经济损失。该病主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起。GP5蛋白及M蛋白作为PRRSV的主要结构蛋白,可诱导中和抗体的产生,在致病及免疫过程中起重要作用。本研究旨在筛选GP5蛋白及M蛋白抗原表位,同时利用筛选到的抗原表位多肽分别建立Peptide-ELISA检测方法,为研究PRRSV抗原抗体相互作用奠定基础,为PRRS的疫苗免疫效果评估,抗体检测以及流行病学调查提供有效的检测手段。本实验利用生物信息学方法对PRRSV GP5蛋白、M蛋白的氨基酸序列进行分析,根据GP5蛋白、M蛋白胞外区设计合成多肽。首先合成GP5蛋白胞外区（32-63 aa）、M蛋白胞外区（1-16 aa）,并根据GP5蛋白胞外区设计合成三条重叠8个氨基酸的多肽:GP5-1（32-47 aa）、GP5-2（40-55 aa）、GP5-3（49-63aa）。继续将反应良好的多肽GP5-1、M分别截短合成重叠5个氨基酸的多肽GP5-1-1（32-42 aa）、GP5-1-2（38-47 aa）和M-1（1-10 aa）、M-2（6-16 aa）,将多肽GP5-1-2截短合成3条重叠3个氨基酸的多肽GP5-1-2-1（38-43 aa）、GP5-1-2-2（41-45 aa）、GP5-1-2-3（43-47 aa）,共合成多肽12条。并在多肽N端加一个半胱氨酸用于偶联。（1）利用Dot-blot方法和ELISA方法筛选鉴定GP5蛋白、M蛋白抗原表位;（2）以筛选到的抗原表位多肽GP5-1:32SNNSSSHIQLIYNLT-L47、M:1MGSSIDDFCNDSTAPQ16为靶标分别与BSA偶联,建立检测PRRSV抗体的Peptide-ELISA方法,并对工作条件进行优化。（3）以Marc145细胞为靶细胞,通过多肽抑制PRRSV感染Marc145细胞实验,筛选可阻断病毒感染的多肽。结果显示:（1）Dot-blot方法和ELISA方法筛选到的GP5蛋白抗原表位为GP5-1（32-47 aa）,对其进行截短筛选,得到截短抗原表位为:GP5-1-2:38HIQLIYNLTL47。M蛋白抗原表位为M（1-16 aa）,对其截短筛选得到抗原表位为:M-1:1MGSSIDDFCN10。（2）通过感染抑制实验,得出GP5蛋白胞外区（32-63 aa）和多肽GP5-2:40QLIYNLTLCELNGTDW55在0.625μg/m L、1.25μg/m L、2.5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L浓度下可以抑制PRRSV感染Marc145细胞,且随着多肽浓度的增加,阻断病毒感染细胞的作用增强。（3）利用筛选到的抗原表位多肽GP5-1、M分别建立Peptide-ELISA抗体检测方法,结果显示:BSA-GP5-1的最佳包被量为0.25μg/孔,血清稀释度为1:200。BSA-M的最佳包被量为0.5μg/孔,血清稀释度为1:200。两条多肽与PCV2,CSFV阳性血清均无交叉反应,批内、批间重复性实验的变异系数均小于10%。利用建立的多肽ELISA抗体检测方法以及IPMA方法和IDEXX试剂盒同时对85份临床猪血清样品进行检测,IPMA方法的检出率为78.82%,分别以BSA-GP5-1、BSA-M为包被原建立的两个Peptide-ELISA检测方法结果一致,检出率为85.88%,IDEXX试剂盒的检出率为95.29%。Peptide-ELISA与IPMA和IDEXX试剂盒的符合率分别为92.24%和90.59%。由此得出本研究建立的Peptide-ELISA方法比IPMA方法的检出率高,在用于PRRSV抗体检测与诊断方面具有良好的应用前景。本试验成功筛选到GP5蛋白、M蛋白抗原表位,并用其建立了安全、特异性好、稳定性高的Peptide-ELISA检测方法。成功筛选到可阻断PRRSV病毒感染Marc145细胞的多肽。为PRRSV抗体检测试剂盒的研发提供技术支持,为PRRSV的防控与治疗提供新思路。
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